羊种布鲁氏菌感染胚胎滋养层细胞的分子机制研究

【摘要】：布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一类动物源性人兽共患病,在世界范围内广泛流行,尤其是发展中国家。近几年回升势头迅猛,引起了世界范围的广泛关注,为此,我国紧急发布了《关于加强布鲁氏菌防治工作的通知》。布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生致病菌,侵袭力强、传染途径多,人感染后呈持续性感染,目前尚无法根治；家畜感染后主要引发母畜流产,给畜牧业生产造成严重损失。动物胎盘中含有大量的赤藓醇,能够促进布鲁氏菌的生长,布鲁氏菌对胎盘具有显著的亲嗜性,胚胎滋养细胞是母体和胎儿的联系纽带,同时也是布鲁氏菌感染的靶细胞,一旦受到损伤,就会导致流产,但引发流产的分子机制还不清楚。为此,本研究以布鲁氏菌和胚胎滋养层细胞为研究对象,主要展开以下的研究工作： 1.羊种布鲁氏菌的分离鉴定及ELISA检测方法的建立。通过采用细菌群体形态观察、PCR、生化试验对分离培养的菌株进行鉴定,获得了羊种布鲁氏菌生物3型1株,命名为027株,对其SP41基因进行克隆、表达、纯化,包被酶标反应板并进行样本检测。结果布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的最优条件是重组蛋白SP41最佳抗原包被浓度为0.6μg/mL,最佳血清稀释度为1：50,该方法重复性好、特异性强,样本阳性检出率高于虎红平板试验和试管凝集试验。 2.羊种布鲁氏菌ery操纵子在感染人胚胎滋养层细胞HPT-8过程中的表达调控。采用实时定量PCR方法检测了布鲁氏菌侵染HPT-8细胞过程中ery操纵子4个基因在未侵染、侵染20min、1h、2h、3h、4h时的表达差异,结果ery操纵子在侵染前后的表达有明显差异,eryA、eryB、eryC相对表达量在侵染2h时表达量最高,eryD在3h时的相对表达量最高,其余状态下的表达量都很低,并且随着eryD表达量升高,eryA、eryB、eryC的表达量降低。 3.建立羊种布鲁氏菌027株侵染HPT-8细胞的cDNA文库。分别提取布鲁氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8细胞总RNA,逆转录合成cDNA,同源重组法构建布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,并对部分EST进行测序分析,结果羊种布鲁氏菌027株侵染人滋养层cDNA文库的库容为1.43×106,重组率为96.92%,插入片段大小在0.2-5kb；对文库63个克隆进行测序,用BlastX和BlastN进行序列同源性比对,并将63个基因进行了功能分类。然后,构建pGBKT7-omp25诱饵质粒,转化酵母Y187,结果表明诱饵菌无自激活活性、无毒性。 4.筛选并验证与布鲁氏菌流产相关因子互作的HPT-8细胞靶蛋白。采用酵母双杂交技术筛选与布鲁氏菌外膜蛋白OMP25互作的HPT-8细胞捕获蛋白,并采用免疫共沉淀技术验证互作的蛋白。共筛选出了7个与布鲁氏菌OMP25诱饵蛋白相结合阳性捕获蛋白,验证试验表明布鲁氏菌外膜蛋白OMP25与HPT-8细胞的Ferritin、hypothetical LOC339123蛋白发生了相互作用。 5.分析捕获蛋白在布鲁氏菌侵染HPT-8细胞过程中的作用。根据铁蛋白、hypothetical LOC339123蛋白核苷酸序列,分别构建了3个特异性shRNA干扰载体,转染HPT-8细胞,实时定量PCR检测2个基因的表达水平,检验其干扰效率；采用布鲁氏菌感染转染shRNA干扰载体前、后的HPT-8细胞,检测布鲁氏菌的相对数量。结果针对铁蛋白、hypothetical LOC339123合成的shRNA干扰片段与各自的混合组的干扰效果基本一致,Ferritin混合组的干扰抑制率为76.18%, hypothetical LOC339123混合组的干扰抑制率为71.11%。针对铁蛋白的干扰载体混合组转染前后,布鲁氏菌相对数量差异较大,而hypotheticalLOC339123的差异不明显。 以上研究结果表明,分离培养的布鲁氏菌027株为羊种布鲁氏菌生物3型；成功构建了基于重组蛋白SP41的布鲁氏菌病间接ELISA检测方法；布鲁氏菌感染HPT-8细胞过程中ery操纵子4个基因在不同时间点表达存在着差异；成功构建了羊种布鲁氏菌027株侵染HPT-8细胞的cDNA文库；布鲁氏菌OMP25蛋白与HPT-8细胞的Ferritin、hypothetical LOC339123发生了相互作用,Ferritin与布鲁氏菌感染相关,hypothetical LOC339123与布鲁氏菌感染不相关。通过本研究,为揭示布鲁氏菌引发流产的分子机制提供线索,也为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。