绵羊甘露糖结合凝集素基因（MBL）与支原体肺炎的相关性研究

【摘要】：甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性期蛋白,属于胶原凝集素家族,广泛存在于肝脏及血液中。MBL通过激活补体和调理吞噬作用在抗感染的起始阶段起主导作用,是一种重要的天然免疫防御分子。MBL生物学功能的实现有赖于其完整的蛋白质结构,MBL结构基因突变影响了蛋白多聚体的功能性和稳定性,使得MBL血清浓度明显降低,机体的免疫防御和监视能力削弱,导致机体对多种病原的易感。另外,由于发展集约化养羊和引种需要,绵羊支原体肺炎在新疆尤其北疆地区新引进的湖羊群体中呈爆发性流行,且该病难于控制和消灭。 基于已有的人MBL基因多态性、MBL血浆浓度及疾病3者之间的关系,本研究以绵羊支原体肺炎为疾病模型,首次克隆绵羊MBL基因的DNA全长序列,了解MBL基因的结构特征,通过MBL血浆蛋白浓度和相应基因多态性的分析,筛选出可引起绵羊血浆中MBL表达量改变的突变位点,证实这些突变位点与绵羊支原体肺炎感染率间的关系,并对不同基因型中国美利奴羊进行人工感染试验,验证绵羊MBL基因多态性与绵羊支原体肺炎感染之间的相关性,筛选出绵羊MBL基因抗支原体肺炎基因型,研究结果如下： 1、绵羊MBL基因DNA全长序列克隆及生物信息学分析：以人和牛的MBL基因序列为参考,分段设计9对引物,采用普通PCR技术,测序,使用DNAMAN软件拼接及分析,首次克隆到长为4462bp的绵羊MBL基因组DNA的拼接序列,囊括了该基因的启动子区,4个外显子,3个内含子,编码249个氨基酸;BLAST分析其与牛MBL-C编码的氨基酸同源性最高为96.39%,判定其为MBL-C型基因,并将该序列提交至GenBank (Accession No. FJ977629);通过Expasy网站预测其蛋白结构功能特征,1-19氨基酸为绵羊MBL基因信号肽区域,外显子1编码N-端富含胱氨酸区和8个Gly-X-Y重复序列的胶原样区,外显子2含有12个Gly-X-Y的胶原样区,外显子4编码的碳水化合物识别域(CRD)具有C型凝集素CRD的共同特征。 2、湖羊MBL基因外显子与内含子多态性检测：利用PCR-SSCP方法,对湖羊MBL基因4个外显子和3个内含子进行遗传多态性分析。分析表明湖羊MBL基因第1、3、4外显子和3个内含子均存在比较丰富的多态性,外显子2未检测到多态性。外显子1的SSCP分析检测到4种基因型,由3种等位基因控制;外显子3中检测到3种基因型,由2种等位基因控制；外显子4分析中检测到3种基因型,分别由2种等位基因控制；内含子1检测到3种基因型,由2种等位基因控制；内含子2各检测到3种基因型,分别由2种等位基因控制；内含子3检测到3种基因型,由2种等位基因控制。不同基因型经克隆测序及序列分析,结果表明首次检测到外显子1、3、4的13个新的突变位点,其中8个同义突变(g.27T C、g105CT、g.2017C G、g.2018TG、g.2049TA、g3334CT、g.3235CT),5个错义突变(g41TA(Val14Glu)、g43GA (Val15Met)、g83AG (Glu28Gly)、g.3243 A G (Glu 181 Gly)、g.3257 GA (Gly 186 Ser));首次检测到3个内含子区域的6个单核苷酸突变位点,分别是内含子1的g.288TA,内含子2的g.1091 TC、g.1096AC、g.1770GC,内含子3的g.2297CT、g.2331GA。另外,首次检测到湖羊MBL-A型外显子1区域序列,较MBL-C型少9个核苷酸序列。 3、湖羊MBL基因外显子和内含子多态性与MBL血清水平的相关性研究： 利用ELISA方法检测湖羊MBL血清水平,通过One-Way ANOVA进行其与MBL基因外显子和内含子不同基因型的差异显著性分析,结果表明MBL血清水平在外显子1上BB基因型显著低于CC基因型(P0.05)、外显子4的GG基因型显著低于HH基因型(P0.05)；预测BB基因型、GG基因型与疾病的易感性相关,而CC基因型、HH基因型与疾病的抗性相关。内含子1的AA基因型显著高于BB基因型、内含子2的CC基因型显著高于DD型、GG基因型显著高于HH基因型,因此,AA型、CC型、GG型有可能与疾病的抗性相关,BB、DD、HH基因型有可能与疾病的易感性相关；外显子3的同义突变及内含子3的点突变未引起MBL血清水平差异。 4、不同绵羊品种MBL基因外显子1、4和内含子2、3多态性比较分析：利用PCR-SSCP方法,首次检测到德国美利奴羊外显子1的5个突变位点,其中g105CT为同义突变,仍编码脯氨酸,g.27T C (LeulOPhe), g.43 A G (Val 15 Met), g44TA (Met 15 Lys), g86AG (Thr 29 Ser)4处为错义突变；在中国美利奴群体中MBL外显子1发现4个突变位点：g.28CT、g.43AG、g.86GC三个错义突变,分别引起Leu10Phe、Met15Val、Thr29Ser的氨基酸置换,g.105TC为同义突变。因此由上而知,德国美利奴羊、中国美利奴羊和湖羊等不同品种的外显子1存在明显差异,德国美利奴羊、中国美利奴羊仅有g44TA (Met 15 Lys)一个差异。但3个品种内含子2、3和外显子4突变位点一致。同样在德国美利奴羊的外显子1检测出MBL-A型序列,而中国美利奴羊未检出MBL-A型。 5、湖羊不同MBL基因型与绵羊肺炎支原体抗性的相关性研究：利用ELISA方法检测湖羊绵羊支原体肺炎抗体水平,通过t检验对湖羊MBL基因外显子1同一基因型在绵羊支原体肺炎阳性和阴性的个体中的基因型频率进行差异显著分析,结果发现,CC型在健康组中较多(P0.01),推测是绵羊支原体肺炎的抗性基因型。AA型和BB型在绵羊支原体肺炎组中较多(P0.05),提示为绵羊支原体肺炎的易感基因型。 6、不同MBL基因型中国美利奴羊人工感染绵羊肺炎支原体易感性与MBL血清水平的相关性研究：成功在中国美利奴羊上人工感染绵羊支原体肺炎,分析结果得出,中国美利奴羊g.86GC位点的DD基因型个体,经ELISA检测其MBL血清水平显著低于其他基因型,DD型个体绵羊支原体肺炎发病率为78%,表明g.86GC点突变与绵羊支原体肺炎易感性呈显著相关性,而g.43AG、g.105TC突变位点的CC基因型个体其MBL血清水平显著高于其他基因型,且CC型个体绵羊支原体肺炎发病率仅为22%,与绵羊支原体肺炎抗性显著相关性。