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人β防御素的改构及活性研究

郭峰  
【摘要】:目的:以人β防御素(hBDs)为基础,通过改变特定氨基酸序列获得原防御素的突变体,旨在提高其杀菌活力,同时降低盐敏感性,并初步探讨防御素的构效关系与机理。摸索防御素的原核表达途径。 方法:(1)Fmoc法合成防御素,对合成后的防御素进行初步的纯度分析以及结构分析。(2)对合成的防御素进行杀菌以及盐敏感性的分析,并应用透射电镜观察防御素的作用方式。(3)用MTT法对合成防御素进行细胞毒性分析,同时通过溶血实验来分析其对血细胞的毒性。(4)将hBD-3进行原核表达纯化。 结果:(1)在人β防御素1-4(hBD-1-4)中,hBD-3对测试菌有最强的杀菌活力及最强的耐盐活力,对测试菌株的百分之九十杀死率(LD90)在15μg/ml以下。同时,合成的hBD-1抑菌活力很低,LD90超过100μg/ml。合成的hBD-2,4抑菌活力弱于hBD-3(P<0.01),但并没有发现明显的对革兰氏阴阳菌的选择性。(2)hBD-3的N端缺失突变体当失去前9个氨基酸时活性及耐盐能力显著下降(P<0.01),而失去前3个氨基酸的突变体耐盐能力显著提高(P<0.01)。(3)经过I区替换的改构防御素都有着比hBD-3更强的杀菌活力及耐盐能力,而它们各自的N端缺失突变体杀菌活性及耐盐能力降低。(4)改构体在耐盐能力提高的同时,它们的细胞毒性以及溶血毒性也相应提高。(5)电镜结果显示,防御素作用于细菌后,破坏细胞壁的同时造成质壁分离,导致细菌死亡。(6)成功构建了原核表达载体表达出融合蛋白GST-hBD-3。 结论:(1)在hBD1-4中,hBD-3的活性,耐盐能力在所测试的菌株中最强,可以将它作为改构的模板。(2)hBD-3的N端区域对防御素的盐敏感性有着重要作用。(3)hBD-3的I区对防御素杀菌活力有着重要影响。而对于防御素杀菌活性与细胞毒性的关系,需要在后期实验中进一步研究。


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