羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定与α毒素的原核表达和免疫原性研究

【摘要】：目的：产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)是一种广泛分布于水源、土壤等自然界以及动物肠道中的重要病原体，常导致人和家畜多种重要疾病，如：人气性坏疽、食物中毒，牛羊猝死症、羊肠毒血症、羔羊腹泻、禽坏死性肠炎等。由该菌引起的感染发病急、病程短、死亡率高，常给畜禽养殖业造成严重的经济损失。因此，了解和掌握新疆羊源性产气荚膜梭菌主要流行毒素型和菌株耐药状况，开展毒力基因的原核表达和免疫原性研究将为该菌感染的防治提供参考资料。 方法：本文对2010-2012年新疆部分羊场送检病料进行涂片镜检、培养特性观察、生化试验初步分离鉴定出产气荚膜梭菌。用PCR扩增16SrRNA序列，并进行序列测定和同源性比对，对确定为产气荚膜梭菌菌株进行毒素分型，分析新疆地区主要流行毒素型。根据我国卫生部发布的厌氧菌抗微生物药物敏感试验方法(厌氧菌的抗微生物药敏实验标准，2005)选取青霉素，盐酸克林霉素，甲硝唑，头孢曲松，替卡西林等药物对产气荚膜梭菌临床分离株进行药物敏感性检测，了解菌株耐药状况。 参考GenBank（登录号X17300.1）已发表的产气荚膜梭菌α毒素的全基因序列，设计针对α毒素成熟肽序列的引物，采用PCR方法扩增α毒素成熟肽序列，将其插入质粒pET-28b构建重组表达载体pET-28b-cpa。重组载体pET-28b-cpa经PCR、双酶切和测序鉴定后转化BL21(DE3)plysS感受态细胞，用IPTG对重组菌进行诱导表达。表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测，确定其表达形式和反应原性，并对重组菌的表达条件进行优化确定最佳诱导条件。采用Ni-NTA对α毒素进行批量纯化，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化蛋白浓度，将纯化蛋白与弗氏佐剂等体积混合制备亚单位疫苗免疫小鼠，通过抗体检测和攻毒试验评价其免疫效果。 结果：通过病料染色镜检、细菌分离、培养特性观察、生化鉴定和16SrRNA检测结果表明，从临床送检病料中共分离49株产气荚膜梭菌。毒素分型结果显示，毒素A型菌株占61.2%（30/49），毒素B型菌株占2.04%（1/49），毒素D型菌株占36.7%（18/49），表明当前新疆地区羊源产气荚膜梭菌主要流行株为毒素A型和D型。 对实验分离得到的菌株进行药敏实验，结果显示，对甲硝唑、克林霉素、青霉素、头孢曲松、替卡西林耐药菌株分别为79.6%、49.0%、38.8%、12.2%和10.2%。从结果可以看出，我国羊源产气荚膜梭菌耐药情况比较严重。 本实验成功扩增出了α毒素成熟肽序列，其分子量大小为1110bp；构建重组表达载体pET-28b-cpa并转化受体菌，通过目的基因诱导表达，检测结果表明，重组α毒素蛋白分子量为42.1kDa，与预期大小相符，且具有反应原性；对表达条件进一步优化发现，目的基因在25℃，IPTG浓度1.0mmol/L，诱导4h的条件下获得最佳表达，目的蛋白占菌体可溶蛋白的34.6%，且以可溶性表达为主。用重组蛋白制备亚单位疫苗免疫小鼠，结果表明，重组α毒素可以刺激产生抗α毒素抗体免疫应答反应，免疫抗体在免疫后28天达到最高水平（1:6400），并能够对免疫小鼠提供一定的免疫保护作用。 结论：本研究了解和掌握了目前新疆羊临床感染病例中产气荚膜梭菌分离株毒素型流行情况及耐药状况，成功实现了D型菌株α毒素基因的克隆与高效表达，表达产物能够刺激机体产生一定免疫应答反应和免疫保护作用，这为将来开展产气荚膜梭菌多价亚单位疫苗研制提供了相关技术储备。