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靶向Smurf1 HECT结构域的小分子抑制剂的细胞学水平验证

汪呈  
【摘要】:背景/目的:骨质疏松是一种以骨量减少和骨组织破坏为特征并可引起骨折的常见病。随着我国人口老龄化的加剧,该病的患病人数越来越多,给病人和社会带来了沉重的经济负担。虽然其治疗方法较多,但目前最主要的还是药物治疗,如补钙,雌激素替代疗法等。然而,当前治疗骨质疏松的大多数药物的疗效并不理想,其原因在于这些药物主要是通过抑制骨的重吸收来提高骨密度,却难以促进骨的形成。因此,发现促进骨形成的新靶点、研发刺激骨合成的新型药物已经迫在眉睫。为深入探索促进骨形成的新途径,本课题主要筛选针对泛素连接酶Smurf1的小分子抑制剂,它可能会通过促进BMP通路来刺激骨形成,为后续研发骨形成促进剂类药物奠定基础。该类药物有望恢复丢失的骨量,大幅度提高骨密度,降低骨折发生率,对于防治骨质疏松具有重要意义。方法:我们首先利用计算机筛选技术得到了24个候选化合物。然后通过ALP活性检测实验和Western Blot技术对购买的上述候选化合物进行实体筛选,得到了效果最好的两个化合物,其编号分别为B06和B75。接着又进行了ALP染色和WST-1细胞增殖和细胞毒性检测等多种实验,从细胞学水平和分子机制上对B06和B75号化合物都进行了药效评价和验证。最后,采用Py MOL软件将B06和B75号化合物分别与Smurf1 HECT结构域的泛素结合区域进行分子模拟对接,预测了它们的结合构象,并对它们之间的相互作用进行了初步分析。结果:初筛和复筛实验表明化合物B06和B75的综合效果较好,可作为后续研究对象。浓度梯度实验和半衰期实验表明:随上述化合物浓度的提高,Smad1/5的蛋白水平总体上呈明显上升并趋于稳定的状态;加入上述化合物后,随时间的延长,Smad1/5的半衰期也有所延长。磷酸化实验和药效对比实验表明:上述化合物均能够提高p-Smad1的蛋白水平;而在BMP通路激活时它们的药效与MG132很接近。ALP染色和活性检测实验表明上述化化合物能够提高C2C12细胞中ALP的含量及活性。WST-1细胞增殖和细胞毒性检测实验表明:上述化合物能够促进C2C12细胞的增殖,且毒性较小。结论:综上所述,我们发现B06和B75号化合物不仅能通过抑制Smurf1与Ub的结合来提高并稳定内源性Smad1/5的蛋白水平,进而促进BMP信号通路的转导过程,而且还能显著增强C2C12细胞的成骨分化能力和细胞增殖能力。另外,计算机筛选的有关信息和分子模拟对接的图像分析表明上述两种化合物与Smurf1 HECT结构域的泛素结合区域之间结合的都比较牢固,且构象对接良好。因此相对其他实体候选化合物来说,化合物B06和B75的药效更好,且有促进骨形成的潜力。


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