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PSY、LCYE基因在番茄红素合成途径的功能研究

任秀娟  
【摘要】:番茄红素是植物中的一种天然色素,属于类胡萝卜素的一种,也是目前在自然界的植物中发现的最强抗氧化剂之一,能够通过物理和化学方式猝灭单线态氧或捕捉过氧化自由基,其清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E。除了具有强的抗氧化作用外,番茄红素还能够通过各种途径阻断组织细胞在外界诱变剂作用下发生基因突变。同时,番茄红素还是一种低胆甾醇剂,它可以抑制胆固醇生物合成。番茄红素的合成过程包括缩合、脱氢、环化、羟基化及环氧化等一系列反应,其中八氢番茄红素合成酶(PSY)催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)合成1分子的八氢番茄红素,八氢番茄红素再通过八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)的作用生成番茄红素。番茄红素有两条主要的代谢途径,其中一条是通过LCYE的催化生成α-胡萝卜素,并进一步生成叶黄素;另外一条是通过LCYB的催化生成β-胡萝卜素,而β-胡萝卜素是脱落酸(ABA)的前体。目的:番茄红素主要存在于番茄、西瓜、胡萝卜、胡椒等各种水果和蔬菜中,其中番茄果实是番茄红素最主要的来源,因而培育高含量番茄红素的番茄果实成为一大研究热点。本研究试图通过基因工程手段,培育出高番茄红素的转基因番茄种质。方法:以p BI121为载体骨架,用果实特异性表达的E8启动子构建番茄红素合成基因PSY的果实特异性过表达载体;以p CAMBIA1301为载体骨架,同样用E8启动子构建番茄红素代谢基因LCYE的‘hairpin’RNA(hp RNA)的果实特异性RNAi表达载体;用农杆菌介导法转化加工番茄里格87-5;PCR方法鉴定转基因植株;实时定量PCR方法测定基因的转录表达水平;最后再以分光光度计测定转基因番茄果实中番茄红素的含量。结果与结论:1、以加工番茄DNA/RNA为模板,PCR扩增分别得到了167bp的LCYE基因的第三个内含子、2207bp的E8启动子、1280bp的PSY基因,以及337bp的LCYE基因保守序列;其中内含子两侧分别添加了4对同尾酶,PSY基因的末端添加了HA标签序列;测序结果表明成功扩增出了相关目的条带。2、将内含子片段插入p BI221载体,构建出含有内含子间隔序列的中间载体p Ri221;利用p Ri221中内含子两侧的2对同尾酶将LCYE保守序列依次以正向和反向方式分别插入内含子两侧,构建出载体p Ri E8-Lcye;将干扰片段与表达载体p CAMBIA1301相连接,最终构建出果实特异性RNAi表达载体p CRi E8-Lcye。构建过程中的所有载体均经过双酶切或PCR检测,得到了预期条带,此外对过量及RNAi两个表达载体进行了测序,测序结果表明表达载体均构建正确。3、携带PSY过表达载体的农杆菌以叶盘法转化番茄,得到了6棵植株,PCR检测均扩增出了预期条带,表明成功得到了6棵PSY过量表达的转基因番茄;携带LCYE RNAi表达载体的农杆菌同样以叶盘法转化番茄,得到了1棵植株,PCR检测扩增出了预期条带,表明成功得到了1棵LCYE干扰表达的转基因番茄。转基因番茄中基因的表达水平以及番茄红素的含量变化还有待转基因果实成熟后进一步研究。


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