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库尔勒香梨自交不亲和SFBB基因RNAi表达载体的构建与转化

钟颖  
【摘要】:目的:‘库尔勒香梨’(Pyrus sinkiangensis Yü),作为新疆的特色果树,梨属植物具有自交不亲和性,制约新疆梨产业的发展进程。本研究首先建立了库尔勒香梨叶片离体诱导再生的稳定高效再生体系,再利用基因工程技术,针对库尔勒香梨自交不亲和SFBB基因不同的两个区域构建干扰载体,为通过分子手段改良梨自交不亲和性状和培育自交亲和的梨品种奠定一定基础。方法:1、以库尔勒香梨离体培养的继代30天左右的无菌苗叶片为材料,1/2 MS为基本培养基,用TDZ与IBA或NAA分别组合设计配方,探讨不同生长调节剂质量浓度组合对愈伤组织形成率和不定芽形成率的影响,选取最优配方附加不同质量浓度的Ag NO3,获得不定芽再生的最佳培养基。用IBA和NAA分别组合设计生根生长调节剂的配比,根据生根率、平均生根数以及平均生根长度筛选最适宜生根的生长调节剂的配比,建立生根的培养体系。最终建立库尔勒香梨叶片诱导再生植株。2、以新疆自交不亲和梨品种‘库尔勒香梨’的花粉为材料,根据本实验室已获得的1344 bp SFBB基因(SFBBx-gamma(Gen Bank登录号:KU756268))设计引物,以SFBB基因的F-box区和可变区V3两个区域作为干扰目标区域,选用242 bp的棉花基因组DNA序列作为间隔片段,并利用融合PCR的方法构建ihp RNA(intron-containing hairpin RNA)结构,再结合酶切连接的方式构建SFBB基因的F-box区和可变区V3的RNAi植物表达载体,最后运用电击转化法分别将F-box区和可变区V3的重组质粒转化至农杆菌菌株(GV3101)中。3、用叶盘转化法将含有SFBB基因的F-box区和可变区V3的RNAi表达载体的农杆菌转化至库尔勒香梨无菌苗,用GUS组织化学染色法鉴定侵染叶片。利用花粉管通道法对花柱滴加库尔勒香梨自交不亲和基因RNAi表达载体进行转化,对座果率进行差异显著性分析。结果:1、成功建立库尔勒香梨组织培养再生体系,库尔勒香梨叶片诱导不定芽再生的最佳培养基为1/2 MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+Ag NO3 0.5 mg/L,愈伤组织诱导率100%,不定芽形成率84.92%。最适宜香梨再生苗生根的培养配方是:1/2 MS+0.5 mg/L IBA+0.9 mg/L NAA,结合前期暗培养7天,生根率可达100%。2、测序结果表明SFBB基因的F-box区和可变区V3的ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明SFBB基因的F-box区和可变区V3的RNAi表达载体构建成功。最终使用菌液PCR验证,表明构建的两组表达载体成功转入GV3101。3、GUS组织化学染色结果表明,目的基因已经整合到库尔勒香梨叶片的基因组中。SFBB基因的F-box区域和V3区域的RNAi表达载体的柱头滴加转化库尔勒香梨子房后显示其座果率有明显提高。结论:本研究成功建立了库尔勒香梨叶片的再生体系,并构建库尔勒香梨SFBB基因的F-box区域和V3区域RNAi表达载体,分别将SFBB基因的F-box区域和V3区域RNAi表达载体利用叶盘转化法转化至库尔勒香梨离体叶片,利用花粉管介导法转化至库尔勒香梨子房中,并成功验证转化效率,为梨自交不亲和SFBB基因RNAi表达载体的遗传转化奠定了研究基础,对培育自交亲和梨品种、对其他蔷薇科果树自交不亲和性状的改良具有重要的参考价值。


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