有机肥和抑制剂对石灰性土壤氮素转化功能菌群及N_2O和NH_3排放的影响

【摘要】：【目的】我国矿质氮肥施用量过大带来的环境恶效应已引起高度重视。为此,如何减少氮素损失,提高氮素利用效率变得至关重要。从优化氮肥管理的角度上来说,采取化肥减量、配施有机肥或配施脲酶抑制剂(UI)/硝化抑制剂(NI)可以实现农田土壤的氮素养分高效利用。石灰性土壤上氮素转化剧烈,容易导致氮素损失,其中N_2O释放和NH_3挥发是重要氮素损失途径。然而,有机无机肥配施及添加UI、NI或双抑制剂组合(DIs)对石灰性土壤NH_3和N_2O排放的影响仍不清楚,氮素转化关键微生物群落(硝化和反硝化)对其响应尚不明确。因此,本论文研究了化肥配施有机肥以及添加UI、NI或DIs对石灰性土壤氮素转化功能微生物丰度、结构和多样性的影响及对NH_3和N_2O排放的影响,以期揭示石灰性土壤硝化-反硝化微生物群落特征对采用增施有机肥及添加抑制剂后的响应,为石灰性农田土壤施肥优化管理提供理论依据。【方法】本研究包括田间定位施肥试验和室内模拟培养试验两部分。通过田间定位施肥试验,运用荧光定量PCR技术研究了有机肥和化肥配施对土壤硝化微生物(AOA和AOB)以及反硝化功能基因(nirS/nirK/nosZ)丰度的影响,运用高通量测序技术分别研究了氮素转化功能微生物的结构和多样性的变化。同时用静态箱-气相色谱法研究了滴灌棉田N_2O排放的影响。在室内培养试验中,选择两种培养温度(25和35℃),研究了有机肥+尿素+UI(正丁基硫代磷酰三胺,NBPT)、有机肥+尿素+NI(2-氯-6-三氯甲基吡啶,CP)和有机肥+尿素+DIs对氮素转化特征的影响,同样采用荧光定量PCR和高通量测序技术研究了硝化、反硝化菌群群落的影响。通过Picarro(G2508)仪器测定了NH_3和N_2O的排放。运用酶学方法研究了氮素转化关键酶的活性。【主要结果】1)有机无机肥配施添加NBPT或NBPT+CP在25和35℃培养条件下尿素水解完毕的天数分别推迟至22d和15d,添加CP或NBPT+CP在25和35℃培养下可以在土壤中维持较高NH_4~+浓度至69d和56d,并降低土壤NO_3~-的生成。有机无机肥配施添加CP处理或NBPT+CP显著降低了培养初期的微生物量、土壤的表观硝化率和潜在硝化势(P0.05),而显著增加了土壤NH_4~+/NO_3~-和硝化抑制率。温度升高会显著降低脲酶抑制剂NBPT和硝化抑制剂CP在土壤中的有效作用时间(P0.05)。2)有机无机肥配施添加NBPT可以显著降低培养初期土壤脲酶活性(P0.05),其中COM+NBPT或COM+NBPT+CP处理在35℃培养条件下分别较COM降低了脲酶活性47.6和41.2%。有机无机肥配施添加CP或NBPT+CP可以显著降低土壤的亚硝酸还原酶和羟氨还原酶活性,但却显著增加了土壤的硝酸还原酶活性(P0.05)。如在35℃下,COM+CP和COM+NBPT+CP较COM处理分别降低了亚硝酸还原酶活性25.6和28.8%,羟氨还原酶活性比COM处理降低了8.36和26.1%,而硝酸还原酶活性增加了74.8和63.8%。温度升高可以显著增加土壤的酶活性(P0.05)。NH_4~+和pH是导致培养初、中期土壤酶活性发生变化的主要土壤因子。3)连续4年化肥配施不同量牛粪或生物有机肥(3000或6000kg·hm~(-2))对AOA群落没有明显的影响(P0.05),但显著提高了AOB群落丰富度、功能多样性和基因拷贝数(P0.05)。有机肥配施CP或NBPT+CP显著降低了AOB的群落丰富度和基因拷贝数,其中AOB基因拷贝数较COM处理分别降低了76.5和85.8%,但对AOA影响较弱。PCA分析表明,连续不同施肥处理的AOA群落结构没有显著地分开,而化肥配施牛粪或生物肥处理AOB群落结构与CF和CK处理相比有显著差异;有机无机肥配施添加CP或NBPT+CP的AOB群落结构与CF或COM相比有明显的区别(热图分析,图5-6 B)。相关分析表明,土壤潜在硝化势(PNR)与土壤AOB的基因拷贝数呈现极显著相关性(P0.01),由此表明,在石灰性土壤上,连续有机无机肥配施及添加脲酶/硝化抑制剂对AOB的群落丰度、结构和功能多样性有显著地影响,但是对AOA的群落没有明显影响。石灰性土壤上主导氨氧化作用的功能菌是AOB。4)连续4年施用化肥更显著地提高nirK种群丰富度(Chao1指数)和多样性(Simpson和Shannon指数),而有机肥配施化肥较CK相比更能提高nirS和nosZ多样性,有机无机肥配施添加CP可以显著降低nirS和nirK的功能多样性。qPCR结果表明,CF较CBF2(60%化肥+6000 kg·hm~(-2)生物肥料)和COM2(60%化肥+6000 kg·h m~(-2)牛粪)处理提高了nirK基因拷贝数36.5和20.9%,而COM2和CBF2处理的nirS和nosZ的基因拷贝数较CF相比平均提高了35.8和31.7%。有机无机肥添加NBPT或CP以及二者组合(COM+NBPT+CP)均显著降低了nirK的基因拷贝数(P0.05),对nirS和nosZ基因丰度也有降低作用,但仅在COM+NBPT+CP处理下与COM处理达到显著差异水平,分别降低了40.9和20.0%。连续4年有机无机肥配施的nirS、nirK和nosZ菌群结构与CK和CF相比有显著差异,而有机无机肥配施添加CP的反硝化的菌群结构也发生改变。相关性分析显示亚硝酸还原酶活性(NiR)在大田连续有机施肥下与nirS呈现显著相关,而在添加抑制剂条件下与nirK和nirS分别呈极显著(P0.001)和显著相关(P0.05)。5)有机无机肥配施添加CP或NBPT+CP可显著降低N_2O排放通量,其中以COM+NBPT+CP处理效果最优。COM+CP或COM+NBPT+CP显著降低N_2O累计排放量66.2和76.8%(35℃培养条件)。有机无机肥配施添加NBPT显著降低了NH_3的排放通量和累计排放量,但添加CP后却极显著促进了NH_3排放,而有机肥耦合双抑制剂(COM+NBPT+CP)较单独添加CP(COM+CP)处理的NH_3排放峰值在25和35℃下可分别降低24.2和57.5%。温度升高会对N_2O和NH_3累积排放量有明显正效应。综合两种气态氮损失,有机肥仅配施CP处理的损失量最高,在25和35℃条件下分别占纯氮施用量的9.62%和15.7%,而有机肥配施NBPT+CP较单独配施CP可以显著降低两种气体损失之和。6)连续有机施肥后导致AOB群落结构变化的最关键因子是pH。NO_3~-、NH_4~+和NH_4~+是导致连续增施有机肥下nirK、nirS和nosZ结构变化的关键因子;NO_3~-、SOC和pH是显著影响有机无机肥配施添加抑制剂下反硝化菌群数量变化的土壤因子。土壤环境因子NO_3~-、pH和NH_4~+对N_2O排放的贡献排在前三位,AOB和nirS是影响N_2O排放的关键微生物因子。土壤NH_3的排放主要受pH和NH_4~+的影响。【结论】1)有机无机肥配施添加NBPT可明显延缓尿素水解,降低脲酶活性,添加CP显著提高了土壤中的NH_4~+,降低土壤微生物量以及亚硝酸还原酶和羟氨还原酶活性,但显著增加了硝酸还原酶活性。2)石灰性土壤上AOB群落对连续有机施肥及有机肥耦合硝化抑制剂更敏感,而AOA对其响应较弱,主导石灰性土壤的氨氧化过程的微生物是AOB。3)连续4年单施化肥或有机无机肥配施均显著影响了nirK群落,而nirS和nosZ群落仅对有机施肥响应敏感。有机无机肥配施添加CP或NBPT+CP显著降低了nirK基因丰度,改变了其群落组成,而对nirS和nosZ数量、结构的影响若于其对nirK基因。4)有机肥配施化肥较化肥单施降低了N_2O排放,对NH_3排放没有影响,添加NBPT可显著降低NH_3排放,添加CP显著降低了土壤N_2O排放,却显著促进NH_3的挥发。有机肥配施双抑制组合NBPT+CP可有效缓解NH_3损失。5)温度升高会显著增加土壤酶活性(P0.05),明显促进N_2O和NH_3的损失,缩短了NBPT和CP在土壤中的作用时间。6)连续有机无机肥配施下影响AOB结构变化的关键因子为pH,NO_3~-是引起土壤硝化-反硝化菌群数量以及N_2O排放最关键土壤因子。AOB和nirS是与N_2O排放最紧密的微生物因子。pH和NH_4~+对NH_3排放贡献最大。