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环磷酰胺在布鲁氏菌M5侵染小鼠/巨噬细胞RAW264.7过程中的作用

周光普  
【摘要】:目的:布鲁氏菌是一种引起人兽共患“布鲁氏菌病”的病原菌,能够在宿主体内长期寄生。本文利用环磷酰胺(CYP)的细胞毒性作用,使受试昆明小鼠处于暂时性的免疫抑制状态,从而探究布鲁氏菌M5侵染免疫抑制状态小鼠的过程与机制;在体外状态,用12.5μmol L~(-1)和25μmol L~(-1)浓度的CYP刺激RAW264.7,探究CYP对RAW264.7吞噬及杀灭布鲁氏菌能力的影响,以及NO等细胞因子的浓度。为布鲁氏菌侵染过程、引起宿主炎症反应以及免疫逃避研究提供新的思路,为进一步研究宿主细胞与病原菌的相互作用提供数据并奠定基础。方法:设免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)组,空白对照(CK)组,环磷酰胺与布鲁氏菌M5结合(CYP+B.melitensis)组和布鲁氏菌(B.melitensis)组,各组昆明小鼠连续7 d腹腔给药40 mg kg~(-1)的CYP或等剂量的生理盐水,之后腹腔接种1×10~6 c.f.u布鲁氏菌,于3、7和14 d后取材。检测小鼠体重食量,脏器质量,脏器相对质量,组织细菌数,免疫组织化学观察,IFN-γ、TNF-α和NO细胞因子的释放;在体外用12.5μmol L~(-1)和25μmol L~(-1)浓度的CYP孵育RAW264.7细胞2 h,之后按细菌比细胞100:1的比例侵染M5,把未孵育的细胞做对照组,c.f.u法检测在侵染2 h、12 h和24 h时胞内活菌数,细胞上清IFN-γ、TNF-α和NO细胞因子含量,激光共聚焦显微镜观察细胞状态,流式细胞技术检测2 h时含有GFP的细胞百分比。结果:(1)小鼠连续7 d腹腔注射40 mg kg~(-1)CYP,体重下降超过30%,外周血白细胞、淋巴细胞和粒细胞数量下降超过50%。(2)CYP+B.melitensis组和B.melitensis组的脏器相对质量显著高于CK组(P0.05),CYP组的脏器相对质量显著低于CK组(P0.05)。(3)CYP+B.melitensis组脾脏、肝脏和肺脏的c.f.u细菌数显著高于B.melitensis组(P0.05)。(4)免疫组化结果显示CYP加剧巨噬细胞浸润。(5)B.melitensis和CYP+B.melitensis组血清中的IFN-γ和NO细胞因子含量显著高于CK组(P0.05)。(6)侵染2 h时,CYP组RAW264.7胞内活菌c.f.u计数显著低于对照组(P0.05),24 h时显著高于对照组(P0.05)。(7)流式细胞检测结果显示,对照组绿色荧光细胞百分比为47.1%,12.5μmol L~(-1)浓度CYP组绿色荧光细胞百分比为26.2%,25μmol L~(-1)浓度CYP组绿色荧光细胞百分比为18.1%。结论:腹腔连续7 d注射40 mg kg~(-1)CYP,能够使昆明小鼠产生暂时的可恢复的免疫能力低下,细胞实验结果表明CYP对RAW264.7吞噬以及杀灭布鲁氏菌的能力有一定抑制作用。CYP为布鲁氏菌在昆明小鼠体内的繁殖创造了更加便利的条件,小鼠体内细菌负担增加,这种结果不应当仅仅归因于免疫细胞数量减少导致的,免疫组化结果显示有大量巨噬细胞募集在组织中,并且在血清中释放了更多的细胞因子。综合试验结果,小鼠体内细菌负担加重现象可以解释为细胞杀菌能力下降以及细胞抗感染的浸润类型两者相结合的影响。


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