新型结核病疫苗菌株对T细胞免疫记忆的影响及其机制研究

【摘要】：目的:本实验研究以本课题组前期构建及鉴定的新型结核病疫苗菌株(B/R菌株)为研究对象,比较研究BCG菌株、H37Ra菌株和B/R菌株对T细胞免疫记忆的影响,探讨研究B/R菌株的抗结核免疫保护作用及其机制,为B/R菌株作为新型结核病疫苗菌株提供理论依据。方法:1.疫苗菌株的制备:BCG、H37Ra菌和B/R菌株分别接种于改良罗氏培养基上,培养3周,制备成1?10~7CFU/m L菌悬液。2.动物分组及免疫:分为PBS组、BCG组、H37Ra组和B/R菌株组。分别采用相应菌株的菌悬液,皮下注射,单次免疫C57BL/6小鼠(1?10~6CFU/100u L/只),PBS组,注射等体积PBS作为阴性对照。3.免疫小鼠后,评价B/R菌株对T细胞免疫记忆的建立和维持的影响:免疫小鼠后8周、12周和16周时,收集小鼠血清及脾淋巴细胞。应用ELISA方法,检测免疫小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平;应用流式细胞技术,检测免疫小鼠脾脏CD4~+和CD8~+T细胞中效应型记忆性淋巴细胞(T_(EM))和中央型记忆性淋巴细胞(T_(CM))的水平。4.特异性抗原刺激后,评价B/R菌株对记忆性T细胞的影响:免疫小鼠后8周、12周和16周时,提取小鼠脾淋巴细胞,体外PPD刺激并培养,收集细胞上清及细胞。应用ELISA方法,检测小鼠脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1/Th2型细胞因子的水平;应用流式细胞技术,检测经PPD刺激后,CD4~+和CD8~+T细胞中T_(EM)和T_(CM)的水平;应用CFSE标记法,检测CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的增殖能力。5.评价B/R菌株免疫小鼠后的短期免疫保护效果:通过HE染色法判断小鼠肺脏和脾脏病理损伤程度;通过脏器组织中的菌落数(CFU)计数,分析疫苗免疫后对结核分枝杆菌的清除能力。结果:1.B/R菌株对小鼠T细胞免疫记忆的建立及维持的影响:免疫小鼠后8周时,B/R菌株组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平,高于BCG组(P(27)0.05);与H37Ra组相比较,无统计学差异。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平,与BCG组和H37Ra组相比较,均无统计学差异。免疫小鼠后16周时,B/R菌株组小鼠血清IFN-γ水平高于BCG组(P(27)0.05);与H37Ra组相比较,无统计学差异;B/R菌株组小鼠血清IL-2水平,与BCG组和H37Ra组相比较,均无统计学差异。免疫小鼠后8、12、16周时,与PBS组相比较,B/R菌株组的CD_8~+T_(CM)除12周时有所降低外,CD4~+、CD8~+T细胞中T_(CM)及T_(EM)数,均显著升高(P(27)0.05)。随免疫时间延长,与BCG组相比较,B/R菌株组在16周时可维持更高水平的T_(EM)(P(27)0.05)。2.特异性抗原刺激后,B/R菌株对小鼠T细胞免疫记忆的影响:在免疫后的早期(即8周时),各疫苗组脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2水平,差异无统计学意义。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组分泌的抗原特异性IFN-γ水平,高于BCG组(P0.05);此时的IL-2水平略高于BCG组,但差异无统计学意义。随免疫时间的延长,B/R菌株分泌的IFN-γ和IL-2,在16周时均显著高于BCG组和H37Ra组(P0.05)。各时间点,Th2型细胞因子IL-4的含量在四组之间均无统计学差异。免疫小鼠后8周时,B/R菌株组CD4~+、CD8~+的T_(CM)和T_(EM)水平,与BCG组相比较,无统计学差异;与H37Ra组相比较,CD4~+T_(EM)有所降低(P0.05)。免疫小鼠后12周时,B/R菌株组CD4~+T_(CM)和T_(EM)以及CD8~+T_(CM)水平,与BCG组和H_(37)Ra组相比较,无统计学差异,CD8~+T_(EM)高于BCG组和H_(37)Ra组(P0.05)。随时间延长,免疫小鼠后16周时,B/R菌株组的CD4~+、CD8~+T_(CM)和T_(EM)水平,均显著高于BCG组(P0.05)。B/R菌株组的CD4~+、CD8~+T细胞增殖率,在16周时均明显高于BCG组和H37Ra组(P0.05)。3.B/R菌株免疫小鼠后的短期免疫保护效果:B/R菌株组小鼠肺脏和脾脏组织的病理损伤程度,与PBS组相比较,显著减轻;与BCG组相比较,病理变化相当。B/R菌株组肺脏和脾脏的菌落数,与PBS组比均明显减少(P0.05);但各疫苗组间的CFU计数,差异无统计学意义。结论:1.B/R菌株免疫小鼠后,可建立较高水平的免疫保护性记忆细胞,以T_(EM)为主。2.B/R菌株通过唤醒较高水平的记忆性T细胞,以及产生以Th1型为主的免疫应答,发挥免疫保护作用,其免疫记忆至少可维持近4月。3.B/R菌株继承了亲代BCG预防原发感染的优势,具有较好的免疫保护效果,是一种有潜力的结核病疫苗。