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绵羊卵母细胞孤雌激活及冷冻研究

张云生  
【摘要】:对绵羊卵母细胞孤雌激活与冷冻保存进行研究,找出适合绵羊卵母细胞冷冻的方法及程序,为体外受精、核移植和转基因动物的研究与应用提供卵母细胞来源。试验研究了卵母细胞体外成熟时间、乙醇激活处理、冷冻保护剂、冷冻方法,对绵羊卵母细胞孤雌激活及冷冻效果的影响。研究结果如下: (1) 卵母细胞成熟22 h、24h和26 h卵裂率分别为60.7%、75.2%和74.5%,卵母细胞成熟24h的卵裂率较22h卵裂率,具有明显差异(P0.05),与26h卵裂率差异不显著(P0.05);其桑葚胚率38.6%,明显高于26h的桑葚胚率27.3%(P0.05)。 (2) 6-DMAP处理6h组,卵裂率83.4%,较未处理组、2h组卵裂率66.4%、70.3%,有明显差异(P0.05),也高于4h卵裂率79.4%,但差异不显著(P0.05)。 (3) 乙醇浓度7%,激活3min、5min、7min卵裂率分别为76.7%、81.4%和70.4%,差异均不显著(P0.05),激活3min囊胚率13.3%,显著高于激活7min囊胚率9.3%(P0.05)。 (4) 乙醇浓度7%,激活绵羊卵母细胞5min,卵裂率85.5%,与乙醇浓度为5%的卵裂率72.2%,有显著差异(P0.05),桑葚胚率和囊胚率,差异分别不显著(P0.05)。 (5) 用输卵管细胞共培养和颗粒细胞共培养的囊胚率分别为20.4%、18.7%,均高于孤雌胚在胚胎培养液中的囊胚率10.1%,差异显著(P0.05)。共培养的卵裂率71.4%、75.2%,与非共培养的卵裂率75.8%,无显著差异,桑葚胚率之间差异也不明显(P0.05)。 (6) 卵母细胞在EG、DMSO和PROH三种抗冻保护剂20%的浓度时,停留120s后,孤雌激活,并用共培养系统培养,统计其形态正常率、卵裂率、桑葚胚和囊胚率。三种抗冻保护剂中,DMSO组的卵裂率40.6%,低于EG和PROH组,差异极显著(P0.01);桑葚胚率23.2%,也低于EG和PROH组,差异显著(P0.05);囊胚率之间均无明显差异(P0.05)。 (7) 细管法和OPS法冷冻绵羊卵母细胞解冻后,形态正常率9.2%和15.7%,均明显低于用GMP法的形态正常率70.3%,差异达极显著(P0.01);GMP法冷冻绵羊卵母细胞,解冻后激活卵裂率26.5%,桑葚胚率11.9%,囊胚率3.2%,也均高于采用细管法和OPS法冷冻的绵羊卵母细胞,而差异不显著(P0.05)。 (8) 用①组(20%EG+20%DMSO)、②组(20%PROH+20%DMSO)和③组(10%PROH+10%DMSO+20%EG)冷冻液冷冻绵羊卵母细胞,解冻后形态正常率②组为58.8%,分别低于①组74.7%和③组73.1%,差异达极显著(P0.01):卵裂率①组27.8%,明显高于②组17.7%(P0.05),与③组差异不明显(P0.05);②组桑葚胚率为7.5%,显著低于①组和③组16.4%、11.3%(P0.05),而①组与③组的桑葚胚率无明显差异(P0.05)。


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