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磷酸甘露糖异构酶基因表达载体的构建及植物遗传转化正筛选系统的建立

王延蛟  
【摘要】: 根据GENBANK数据库中大肠杆菌(Escheriachia coli)的磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase PMI)序列设计引物,通过PCR的方法得到约1200bp片段并与克隆载体pGM-T easy连接,经测序证明与已发表PMI序列同源性达到100%。将其作为选择基因,构建到植物表达载体pBI-121上,得到可以在含有甘露糖的培养基上筛选的pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI的表达载体。通过对普通烟草(Nicotiana tabacum L.)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)和甜瓜(Cucumis melon L.)(伽师瓜)的甘露糖敏感性测验结果发现:普通烟草和紫花苜蓿不能用此转化系统进行筛选。甜瓜(伽师瓜)和番茄LIGEER 87-5可以用并得到较适合的筛选培养基:甘露糖浓度分别是19%和8%。以甜瓜(伽师瓜)(Cucumis melon L.),番茄(Lycopersicon escμlentum Mill.) LIGEER 87-5为受体材料,通过根癌农杆菌EHA105(pBI-PMI、pBI-NPTII-PMI及pBI-k88-PMI)介导进行转化,获得了一批经甘露糖筛选后的甜瓜和番茄芽,且这些分化芽能够在含有甘露糖培养基上生长。通过氯酚红(CPR)法对转基因甜瓜叶片的磷酸甘露糖异构酶做了定性分析,进一步证明成功建立了以PMI为标记基因的选择系统。实验结果表明,此转化系统可以用于转基因甜瓜和转基因番茄的筛选。


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