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人Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及表达产物的功能研究

张树军  
【摘要】: 目的:构建neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,获取具有天然活性的Neuritin蛋白,并对其进行功能研究,为进一步探讨neuritin的功能及作用机制奠定基础。 方法:PCR扩增neuritin ORF,将其克隆到穿梭质粒pPIC9K中,转化DH5α菌,经PCR和测序鉴定;抽提测序正确的pPIC9K-neuritin重组穿梭载体,线性化后电激转化GS115毕赤酵母菌,使用G418筛选出稳定表达的酵母重组子,经PCR及酵母基因组测序正确;用甲醇诱导酵母重组子分泌表达Neuritin蛋白,并优化诱导表达的条件;表达产物经SDS-PAGE鉴定后,用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化目的蛋白,纯化后的蛋白再经Western-blot鉴定。最后,将纯化的Neuritin蛋白分别加入到PC12细胞和鸡胚背根神经节的培养基中,对其生物学功能进行研究。 结果: 1.构建了neuritin基因片段的重组穿梭质粒pPIC9K-neuritin,经PCR鉴定和序列分析证实,neuritin基因已正确插入穿梭质粒的多克隆位点。 2.获得了neuritin毕赤酵母重组子,经PCR鉴定和序列分析证实,neuritin基因已正确重组入酵母基因组中。 3.用甲醇诱导neuritin酵母重组子表达获取了Neuritin重组蛋白,经SDS-PAGE分析,Neuritin重组蛋白以分泌的形式存在于酵母培养上清中,其分子量约为12KDa。最佳诱导表达时间是72h。 4.用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化Neuritin重组蛋白。经SDS-PAGE分析显示,Neuritin蛋白得到了有效纯化,纯化后的Neuritin蛋白经Western- blot证实确为Neuritin。 5.Neuritin重组蛋白的生物学功能研究结果表明从毕赤酵母中得到的Neuritin重组蛋白有较好的生物学活性:Neuritin既可促进PC12细胞的突起生长,发生类神经元改变;又可促进鸡胚背根神经节的神经纤维生长,延长其存活时间。 结论: 1.成功构建neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,并从表达产物中纯化得到Neuritin蛋白。 2. Neuritin酵母表达蛋白的功能研究结果显示: . Neuritin可促进PC12细胞的突起生长,发生类神经元改变; . Neuritin可促进鸡胚背根神经节神经纤维的生长,延长其存活时间; 表明Neuritin有良好的神经生物学功能。 本研究为进一步探讨neuritin的生物学功能和神经系统疾病的临床应用奠定了良好的基础。


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