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耐盐大豆培育分子策略的探讨

姚燕  
【摘要】: 大豆是主要的油料作物之一,而土壤盐渍化和线虫病严重抑制了大豆的生长和发育,因此,培育耐盐抗线虫大豆新品种对提高大豆产量无疑将产生重要影响。本文的目的是利用农杆菌介导的大豆胚尖高效遗传转化方法,将分别来自三种耐盐性不同的植物的与阴离子清除有关的甲基转移酶基因导入大豆中,以期为植物基因工程探索出一条新途径,同时为大豆的遗传育种提供新资料。 对大豆的灭菌方法、外植体的优化、分化和拔高培养基的优化、生根培养基及生根方法等进行了探索,以建立大豆胚尖高效再生体系;对大豆遗传转化过程中的重要因素如筛选压、菌液浓度、浸染时间、农杆菌抑制剂的使用等进行了研究;分别将来自拟南芥、盐芥和盐地碱蓬的甲基转移酶基因MCT利用农杆菌介导的方法导入大豆中,并利用PCR、RT-PCR、Southern杂交等分子手段对转化子进行了检测。 建立了大豆胚尖高效再生体系:成熟大豆种子浸泡24h后,用1:1的1.2%的次氯酸钠和0.1%的升汞混合液处理大豆10min,收集胚尖并转入芽诱导分化培养基MS+0.08 mg/L TDZ,30d后将长有丛生芽的胚尖转入拔高培养基MS+2.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA中,20d后切取苗高大于5cm的植株,转入生根培养基1/2MS+0.5mg/LNAA中,30d后待根长到3-4cm后移栽到培养土中;优化了大豆胚尖遗传转化体系:卡那霉素选择浓度为90mg/L,菌液浓度为OD_(600)=0.6,浸染时间为12h,可用氨苄青霉素作为农杆菌的抑制剂;AtMCT、ThMCT和SsMCT三种不同的基因转化植株经过筛选分别得到78、67、82株抗性苗,PCR、RT-PCR、Southern杂交等分子手段对转化子的检测结果表现为阳性。 首次利用TDZ诱导大豆胚尖的分化,建立了高效的大豆胚尖再生体系,丛生芽分化率高达92.6%;优化了大豆胚尖遗传转化系统,转化率高达15%;首次将来自拟南芥、盐芥和盐地碱蓬的阴离子清除有关的基因甲基转移酶基因在大豆中进行了异源表达,分子检测结果表明外源基因已转入大豆中并进行了表达。


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