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乌鲁木齐市生活饮用水中有机物现状及其类雌激素效应的研究

鲁英  
【摘要】:目的:目前已知的有机物种类约700万种,其中人工合成的有机物种类达十万种以上且以每年2000种的速度递增。很多有机污染物本身有一定的生物积累性和致癌、致畸、致突变的三致作用,一些有机物对人的生殖功能可以产生不可逆的影响,是人类的隐型杀手。目前,发现我国很多城市的水源水和自来水中的有机物种类和数量相当大,污染问题突出,在一些城市的自来水中检测到了具有内分泌干扰效应的有机物。但是我区尚未开展有关具有环境内分泌干扰效应的有机物的监测工作,而且乌鲁木齐市的主要饮用水来源为冰川融水,其有机污染物可能也会与其他以江河水为主要源水的地方有所区别。本研究旨在确定乌鲁木齐市以地表水为主要来源的入厂水和出厂水中的主要有机物,对其可能来源进行分析,为有机污染的防治提供科学依据,并考察当前的自来水处理工艺对有机物的去除效果,为自来水厂的工艺改革提供参考依据。在此基础上对有机物的雌激素效应进行检测,探究环境有机物的雌激素效应作用机制,探索水环境污染可行的生物标志物。方法:1)于2009年8月上旬采集乌鲁木齐市以地表水为主要源水的三个水厂的入厂水及出厂水各100L。每20L用1支HLB固相萃取柱将水样浓缩,溶剂洗脱,氮气吹干后,用正己烷定容至lml。用GC/MS进行检测,将得到的质谱图与NIST2005库比对检索,对检出的化合物定性。在此基础上,计算检出物的峰面积,确定乌鲁木齐市水中主要的有机物的种类;2)通过一级质谱确定保留时间,摸索合适的碰撞能量,对二级质谱进行优化,建立气相-三重四极杆串联质谱在MRM模式下定量分析邻苯二甲酸甲酯、邻苯二甲酸乙酯、邻苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸戊酯5种邻苯酸酯类物质的方法,并对乌鲁木齐市生活饮用水中所含5种邻苯酸酯类物质进行定量分析;3)根据邻苯酸酯类物质的定量结果和其他各种有机物的峰面积,得到乌鲁木齐市生活饮用水中各种有机物的浓度。根据CAS号,在MSDS和Chemical book数据库中检索三个水厂入厂水和出厂水中有机物的LD50,并查阅相关国家标准。以LD50为纽带,以有国家标准的物质为基准,对尚未设立国家标准的水中有机物进行限值估计,将其引入Nemerow指数,对水质进行综合评价。Nemerow指数越高,水质越差;4)选择体重15.93±2.67克的健康清洁级ICR雄性小鼠50只,适应性喂饲1周后,随机分为5组,每组10只。分别将HLB柱浓缩的各出厂水的有机物提取物溶于DMSO中。设对照组(0.25 mL·kg-1DMSO组)低剂量(1.25L水中有机提取物·kg-1组)、中剂量(2.5L水中有机提取物·kg-1组)、高剂量(5L水中有机提取物·kg-1组)、17β-雌二醇(1mg·kg-1)5个剂量组。每天经口灌胃给予各组小鼠饮用水有机提取物,连续染毒15天,称重,眼球采血,处死小鼠后,取睾丸进行SOD、MDA、ACP、AKP、γ-GT活力各项指标的测定,并检测血清中的睾酮和卵泡刺激素;5)37℃、5%CO2、100%湿度在96孔培养板中用无酚红的DMEM/F12去激素血清培养基培养MCF-7细胞,以无水乙醇为溶剂对照,17-p-雌二醇(分别以10-6mol/L、10-9mol/L、10-12mol/L)为阳性对照,实验组为6个水样提取物,每个提取物设相当于原水量500 ml、1000ml和2000 ml的低、中、高3个剂量组,每个剂量设4个复孔。以Alamar Blue为细胞增殖检测剂,分别在12小时、24小时、48小时后用酶标仪测定各孔吸光度值(A),并计算平均A值和增殖率。根据细胞增殖情况,选择中、高剂量组(即每个提取物设相当于原水量1000 ml和2000ml),在12孔板中无酚红去激素血清培养MCF-7细胞48小时,染毒24小时,trazol法提取总RNA,进行逆转录。从样品中随机抽样,用普通PCR扩增Hsp90AAl基因、ERa基因、ERRa基因,进行凝胶电泳,在紫外灯下切胶,得到上述基因的纯品。分别将所得的各基因的纯品按101、102、103、104、105、106、107浓度梯度稀释,用dEPC水做阴控,采用实时荧光定量PCR仪制备各基因的标准曲线。采用实时荧光定量法对Hsp90AA1基因、ERa基因、ERR基因表达进行定量分析;6)将MCF-7细胞在24孔培养板中用无酚红去激素血清培养基培养24小时后,以无水乙醇为溶剂对照,实验组为6个水样提取物,浓度为各水样增殖率最高的剂量组,细胞爬片,用荧光免疫化学法检测测Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达情况,计算Bcl-2/Bax比率。结果:1)确定了乌鲁木齐市以地表水为主要来源的入厂水和出厂水中的主要有机物有烷烃类、酯类、羧酸类、芳香烃、酮类、醇类、烯烃类、酰胺类共计8大类39种,其中烷烃类在各水样中检出最多,其次为酯类、羧酸类、芳香性化合物,但与其他省市的同类研究比较,乌鲁木齐市的地表水源污染物的种类较少;2)乌鲁木齐市以地表水为主要来源的入厂水和出厂水中的主要有机物在EPA黑名单中的有邻苯二甲酸酯类,包括邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛基酯、邻苯二甲酸丁基辛基酯、邻苯二甲酸二(2-甲基丙基)酯;3)对乌鲁木齐市以地表水为主要水源的三个水厂的入厂水和出厂水中的主要有机物进行分析评价,A厂(红雁池水厂)对烷烃类、酯类、羧酸类和芳香性化合物的去除率要高于B厂(城建股份水厂)和C厂(三甬碑水厂);4)A入厂水的Nemerow评分远高于其他水厂的入厂水,提示A水厂的有机物污染状况较其他水厂严重。各水厂入厂水的评分均高于出厂水的评分,说明出厂水水质优于入厂水;5)动物实验结果显示,乌鲁木齐市以地表水为主要原水的三个自来水厂的出厂水中的有机物对雄性小鼠未呈现出明显的抗雄激素作用;6)MCF-7细胞增殖实验染毒24小时后,阴性对照组与水样高、中剂量组的差异有统计学意义,与低剂量组无统计学差异;阳性对照的中剂量组与水样各剂量组的差异有统计学意义。阳性对照中剂量组对MCF-7细胞促增殖率最大,染毒24小时后,高、中剂量组的促增殖效应强于低剂量组,但是染毒48小时后,各水样低剂量组几乎都显示出了较高、中剂量组更强的增殖率;7)各组的Bax蛋白荧光灰度值之间有统计学差异(P0.05),各实验组Bax蛋白荧光灰度值低于阴性组。各组的Bcl-2蛋白荧光灰度值之间有统计学差异(P0.05),除C出厂水组外,其它各实验组Bcl-2蛋白荧光灰度值高于阴性组。各组的Bcl-2/Bax比率(Bcl-2蛋白荧光灰度值与Bax蛋白荧光灰度值的比)之间有统计学差异(P0.05),各实验组的Bcl-2/Bax比率均高于阴性组(P0.05);A入厂水组、B入厂水组和C入厂水组的Bcl-2/Bax比率分别高于A出厂水组、B出厂水组和C出厂水组(P0.05);8)hsp90AA1的表达在高剂量组各水厂的入厂水和出厂水之间比较均存在显著性差异。B厂入厂水高剂量组MCF-7细胞hsp90AA1的表达上调,明显高于A、C水厂,但是B厂出厂水高剂量组对MCF-7细胞hsp90AA1表达的影响,与其他各水厂的出厂水相比,并未显示出显著性差异;hsp90AA1、ERa、ERRα基因表达呈明显正相关,hsp90AA1表达和ERα、ERRα表达的Pearson相关系数分别为0.988和0.944(P0.05)。结论:乌鲁木齐市以地表水为主要源水的生活饮用水中的有机污染状况与我国其他地区相比污染程度较轻。水样作用而导致的细胞增殖现象,不是典型的通过核受体途径影响ERa的转录而产生的,更多的是依赖于非基因组效应。鉴于hsp90对环境污染物的敏感性及其表达与ERα和ERRα的相关性,建议将hsp90作为环境雌激素的效应标志物。


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