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基于代谢组学技术的糖尿病特征代谢物及维医证型研究

马晓丽  
【摘要】:目的: 本文采用1H-NMR、UPLC/TOF-MS作为代谢组学研究的检测手段,以糖尿病患者和正常人的尿液为研究对象,分析了糖尿病患者尿液的特征代谢谱;进一步采用HPLC和GC法的代谢靶标技术定量测定尿液及血清中氨基酸、脂肪酸类代谢物。采用模式识别方法对与糖尿病相关的代谢物质进行全面的研究,从西医诊断到维医辨证分型等不同层面阐述与糖尿病代谢相关的差异物质,为全面理解糖尿病在发病机制上的差异和联系提供了一个新视角和实验基础。 方法: 1.利用基于NMR的代谢组学方法研究维吾尔族2型糖尿病尿液代谢特征,建立稳定的NMR尿液一维氢谱,分析2型糖尿病人及正常人尿液特征代谢物。根据维医分型将糖尿病患者分为不同体液证型,进一步利用建立的方法寻找不同证型间的差异标志物。 2.采用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(UPLC Q-TOFMS)技术分析糖尿病及正常人尿液的代谢谱,结合多元数据分析寻找糖尿病和正常人的差异物质。根据精确分子量、按照差异代谢物的种类在谱库中进行检索,对其进行系统的鉴定并与NMR结果进行比较。 3.建立高效液相色谱(HPLC)分析生物样品中游离氨基酸的代谢靶标分析技术,以维吾尔族糖尿病及正常人血清/尿液为研究对象,测定氨基酸代谢谱,结合多元统计分析评估氨基酸代谢谱对糖尿病发病的影响。进一步将该方法应用于糖尿病小鼠模型中,充分研究糖尿病小鼠的氨基酸代谢变化。 4.建立气相色谱(GC)技术检测血清中游离脂肪酸的技术平台,优化了GC色谱的最优条件。用该法分析2型糖尿病患者和正常健康者血清的7种游离脂肪酸,结合多元统计分析寻找脂肪酸代谢谱的差异,对脂肪酸代谢异常进行系统评价。 结果: 1.建立了1H-NMR的尿液代谢组学方法,糖尿病患者和正常人经代谢组学方法得到很好的区分,并找到了相对应的多个糖尿病标志物。DM组的大部分代谢物浓度较正常人低。结合两组样品的NMR谱图的不同轮廓,与正常人相比,DM患者尿液中的葡萄糖、马尿酸、甜菜碱、牛磺酸等升高;亮氨酸、异亮氨基酸、肌酸酐、柠檬酸、二甲胺等含量较正常人低。根据维吾尔医分型将患者分为不同异常体液证型,进一步利用NMR技术对不同证型糖尿病及健康人尿液进行代谢组学研究,发现三种异常体液糖尿病患者尿液差异物质相似,异常粘液质患者尿液中的代谢差异与其他两类都有显著差异,成为各个异常体液中代谢变化最为显著的体液类型。 2.建立了UPLC-Q/TOF-MS的尿液代谢组学研究方法,糖尿病患者尿液中的糖、脂、氨基酸等代谢通路都发生了紊乱,在糖类代谢物中,钠葡萄糖醛酸含量明显高于正常对照组,在脂肪酸类物质中,与正常对照组相比,20-羧基花生四烯酸,棕榈酸在糖尿病患者尿液中比在正常人中高。氨基酸类代谢物中,酪氨酸、N-β-丙氨酰-L组氨酸、色氨酸含量较正常人低,戊二酸、烟酰甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等含量升高。这些代谢物均是与体内糖、脂代谢相关的调节物质,进一步说明了糖尿病患者发生了相关代谢紊乱。1H-NMR技术所得到的标记物和UPLC-Q/TOF得到的标记物大部分不同,但是分组聚类结果类似。 3.以反相色谱柱和梯度洗脱对生物样品氨基酸进行HPLC分离。通过色谱条件的优化及对方法学考察,说明选择的衍生化方法重复性好、稳定性高。另外,通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对HPLC得到的氨基酸数据进行分析。研究发现,HPLC分析得到的血清及尿液氨基酸代谢谱能明显表征出糖尿病患者和正常人的代谢表型差异,有效的区分糖尿病患者和健康对照组的氨基酸代谢轮廓。在糖尿病血清氨基酸代谢靶标分析中,糖尿病患者血清氨基酸代谢谱中对分组贡献最大的是天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丝氨酸,而在单维统计分析发现天冬氨酸和苯丙氨酸代谢异常最为明显,较正常人明显升高,而较正常人显著下降的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸和赖氨酸。在尿液的代谢谱比较时发现多元分析中得到丝氨酸、苏氨酸、牛磺酸对组间贡献较大,而单维统计分析发现尿液中牛磺酸、精氨酸、丝氨酸和组氨酸较正常人显著下降,谷氨酸显著升高。两种方法处理得到的结果可以互为补充。在糖尿病动物模型氨基酸谱的研究中发现所有氨基酸在单维统计分析中均无差异,而在多元统计分析中,通过PLS-DA负载图可见,精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、牛磺酸对组间贡献较大,这些氨基酸可能承载着小鼠成模后药理过程中代谢途径变化的重要信息。本研究说明HPLC靶标分析技术可以作为高效和简单的技术平台用于糖尿病的代谢轮廓研究,是一种潜在的早期诊断手段。 4.建立了以硫酸/甲醇为甲酯化试剂测定血清中FFA的GC分析方法,同时优化了GC色谱的最优条件。利用多元统计分析结合模式识别方式,结合PCA和OPLS-DA对数据进行模式识别对两组人群进行了有效区分,发现肉豆蔻酸在糖尿病患者血清中升高,而油酸在糖尿病患者中特异性下调,提示这两种物质可能分别为潜在特异性标志物,为区分糖尿病和体内脂肪酸失衡的关系提供了重要的实验依据。 结论: 1H-NMR技术和UPLC-Q/TOF技术作为常用的代谢组学分析工具,在标记物发现中有一定的互补性。通过对正常人和糖尿病患者尿液的代谢谱研究,发现代谢组学具有很好的疾病诊断作用,进一步将其应用到维医不同证型糖尿病的特异代谢物寻找中,获得了区分不同证型糖尿病的特征代谢物;运用HPLC及GC的代谢靶标分析技术对血清/尿液中的氨基酸、脂肪酸进行定量分析,结合模式识别发现具有良好的聚类效果。代谢组学作为现代生命科学的一个新的分支,对研究糖尿病的潜在标志物研究具有重要价值。


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