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PAd-RFP/BMP2-Mbs复合体转染BMSCs并促其向心肌细胞分化的体外实验

马洁  
【摘要】:目的:探讨携生物素化的骨形态发生蛋白2并标记红色荧光的重组腺病毒-微泡复合体(PAd-RFP/BMP2-Mbs)利用超声靶向爆破微泡定位释放技术(UTMD)体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过BMP2过表达促进BMSCs向心肌细胞定向分化的可行性。方法:提取、分离、纯化大鼠BMSCs,取P3代BMSCs随机分为5组:Ⅰ组:单纯BMSCs组(对照组);Ⅱ组:超声+微泡+BMSCs组(BMSCs+UTMD);Ⅲ组:超声+BMSCs组(BMSCs+U);Ⅳ组:微泡+BMSCs组(BMSCs+M);Ⅴ组:超声+微泡+BMSCs+PAd-RFP/BMP2组(BMSCs+UTMD+BMP2);超声辐照体外转染并培养诱导BMSCs向心肌细胞分化,于转染后24h、48h、72h观察BMP2表达情况,转染72h后检测PAd-RFP/BMP2在BMSCs中的转染率,CCK8法检测BMSCs的活性,转染后72h通过RT-PCR及Western blot检测PAd-RFP/BMP2的m RNA含量及蛋白在BMSCs中的表达,转染后第14天通过Western blot检测心肌特异性蛋白cTnT、Cx43、α-MHC,α-actin的表达,同时以RT-PCR技术检测心脏特异同源转录因子(Nkx2.5)和锌指结构转录因子(GATA-4)的mRNA表达量。结果:观察转染后24h、48h、72h第Ⅴ组的BMSCs,红色荧光细胞数逐渐增多,检测第Ⅴ组红色荧光细胞的数量为80%,第Ⅴ组转染率为85.1%,CCK8值比较:转染组与未转染组吸光度(A)比较无统计学差异(P0.05),RT-PCR及Western blot检测结果显示,BMP2m RNA及蛋白含量仅在第Ⅴ组中存在高表达,与未转染组比较(P0.05);转染后第14天Western blotting检测结果:cTnT、Cx43、α-MHC,α-actin含量在第Ⅴ组中表达量高,转染组与未转染组比较具有统计学差异(P0.05);RT-PCR检测结果:Nkx2.5和GATA-4mRNA含量在第Ⅴ组中表达量高,与未转染组比较有统计学差异(P0.05)。结论:携PAd-RFP/BMP2-Mbs腺病毒-微泡复合物联合UTMD技术可成功转染BMSCs,转染后通过BMP2过表达,可成功诱导BMSCs向心肌细胞定向分化。


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