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KIR分子在泡球蚴感染所致肝脏区域NK细胞功能异常的机制研究

巴音达拉  
【摘要】:目的:泡型包虫病是多房棘球绦虫幼虫感染人体所致的一种恶性致死的寄生虫疾病,有“寄生虫癌症”之称。目前大量的研究工作表明,多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,E.m)感染宿主后可以导致机体处于免疫耐受状态,从而逃避宿主免疫系统攻击。本研究旨在探讨NK细胞表面免疫抑制性分子KIR介导肝AE患者NK细胞功能异常的机制。方法:第一部分,通过27例AE患者肝脏手术标本,病理切片观察AE患者肝脏病灶近端及远端病理的情况,对肝脏病灶近端和远端纤维化程度进行Masson染色检测,利用免疫组织化学检测AE患者肝脏病灶近端及远端KIR2DL1分子的表达变化;利用17例AE患者肝脏手术标本,流式细胞术检测AE患者肝脏区域病灶近端和远端KIR2DL1分子在NK细胞的表达水平,以及NK细胞的相关功能细胞因子表达水平;第二部分,建立泡球蚴经肝门静脉感染小鼠模型。对泡球蚴感染各个阶段(4周、12周、24周)小鼠模型肝脏病灶情况进行研究分析;对肝脏免疫病理变化、微观病灶数量以及病理反应类型展开病理切片观察,依托多阶段E.m感染小鼠模型,流式细胞术检测肝脏区域NK细胞表面受体Ly49A表达水平,以及NK细胞的相关功能细胞因子表达水平。第三部分,通过AE患者及健康对照外周血ALT和AST指标检测AE患者肝脏损伤的变化,采用流式细胞仪和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测AE患者NK细胞的表型和功能。采用多房棘球蚴囊液(EMF)干预人单核白细胞THP-1分化过程。在与NK细胞和EMF-THP-1细胞共培养体系中,我们分别使用KIR2DL1阻断抗体及不使用KIR2DL1阻断抗体抗体的情况下用酶联免疫吸附法(ELISA)分析了NK细胞的功能。结果:第一部分,病灶周围产生“炎症微环境”,淋巴细胞大量浸润,Masson染色结果提示AE患者肝脏组织纤维化程度病灶近旁显著高于远端(Close vs Distance:11.75±0.99%vs2.25±0.27%,P0.0001);免疫组化结果,对比远端肝脏组织,近旁肝脏组织表达KIR2DL1比例相对要更高一些(Close vs Distance:19.37±1.09%vs 5.63±0.39%,P0.0001),流式细胞术检测结果提示:AE患者近旁肝脏组织KIR2DL1分子在CD56+NK细胞里表达比例更高(Close vs Distance:8.49±0.91%vs 5.17±0.40%,P0.05);KIR2DL1+NK细胞群近旁肝脏组织分泌效应分子GranzymeB比例显著低于远端肝脏组织(Close vs Distance:31.20±4.01%vs 50.69±3.16%,P0.05);KIR2DL1+NK细胞群近旁肝脏组织分泌效应分子IFN-γ比例显著低于远端肝脏组织(Close vs Distance:4.71±0.79%vs 9.80±1.74%,P0.05);第二部分,成功建立了E.m经肝门静脉感染小鼠模型,天狼星红染色检测结果提示:在感染4周,泡球蚴感染组肝脏纤维化程度显著高于假手术组(P0.001);在感染12周,泡球蚴感染组肝脏纤维化程度显著高于假手术组和感染4周(P0.001或P0.01);在感染24周,泡球蚴感染组肝脏纤维化程度显著高于假手术组和感染4周(P0.001)。检测不同时间段感染小鼠模型外周血ALT和AST的水平,结果提示:在感染12周,感染组小鼠外周血有着相对更高的ALT水平(Control vs EM:25.14±1.36 vs37.26±2.85U/L,P0.01);在感染24周,感染组小鼠外周血ALT的水平显著高于假手术组(control vs EM:26.16±1.47 vs 49.66±0.92U/L,P0.01);且感染24周,小鼠外周血ALT的水平显高于4和12周(4周vs 12周vs 24周:32.72±4.36 vs37.26±2.85 vs 49.66±0.92 U/L,P0.05或P0.01)。感染24周,感染组小鼠外周血有着相对更高的AST水平(control vs EM:114.70±1.59 vs 141.70±3.55U/L,P0.01);且感染24周,小鼠外周血AST的水平显高于4和12周(4周vs 12周vs 24周:112.50±3.91 vs 118.50±2.75 vs 141.70±3.55 U/L,P0.05或P0.01)。本文采用流式细胞术检测多时间段肝脏区域NK淋巴细胞表面LY49A分子及相关细胞因子的表达变化:在感染中晚期(12周和24周),可见LY49A的表达相对于假手术组明显升高(P0.05);在感染12周、24周分泌效应性细胞因子GranzymeB、IFN-γ和TNF-α能力显著降低(P0.01或P0.05)。第三部分,检测AE患者肝脏损伤的变化,结果表明,AE患者外周血血清有着相对更高的ALT和AST值(HL vsAE:ALT,23.71±5.78 vs 59.4±13.45U/L,P0.05;AST,18.33±2.00 vs 37.49±7.3U/L,P0.05);流式细胞术检测AE患者血液中CD56dimNK细胞比例降低(P0.05)。实时定量PCR结果提示在AE患者NK细胞中IFN-γ、颗粒酶B和CD69的分泌相对于健康对照显著减少,但是KIR2DL1的表达异常升高。泡球蚴囊液处理组中巨噬细胞M2极化标记物精氨酸酶-1、CD206、CD163均高于健康对照组(P0.001),多房棘球蚴囊液(EMF)诱导THP-1细胞向致耐受型表型转化。将这些EMF-THP-1细胞与AE患者分离出的NK细胞共孵育后,NK细胞的功能明显受到阻碍,从而引发细胞毒性,但引入抗KIR2DL1抗体后,这种作用基本被消除。结论:1.AE患者肝脏区域免疫中,作为机体抵御外来病原体入侵的第一线细胞NK细胞的表面抑制性受体KIR明显高表达,从而传到抑制性信号传递,导致肝脏局部NK细胞功能降低。2.泡球蚴感染可通过KIR2DL1调控巨噬细胞,诱导NK细胞功能障碍,导致NK细胞功能耗竭,造成E.m感染在宿主肝脏的慢性寄生,长期共存。


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