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黑果枸杞营养成分分析及其多糖对ARPE-19细胞的保护作用研究

谭扬扬  
【摘要】:目的:分析不同产地黑果枸杞营养成分并对其生药学特征进行初步研究,探讨其主要成分黑果枸杞多糖对氧化应激导致的视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞损伤的保护作用。方法:1.分别选择新疆、宁夏、甘肃、青海四种不同产地黑果枸杞按照国家标准对其水分、灰分、总蛋白、总脂肪、氨基酸及微量元素的含量进行测定,对其粉末进行性状、水试、显微和理化鉴定;2.采用热水浸提法提取黑果枸杞粗多糖,三氯乙酸法脱蛋白,过氧化氢法进行脱色,采用DEAE-52纤维素柱分离多糖,Sephadex G-100进行纯化及纯度鉴定,并利用气相-质谱联用法简单初步分析多糖组成及含量;3.CCK-8法检测不同浓度黑果枸杞多糖对ARPE-19细胞活力的影响;CCK-8法检测不同浓度H2O2诱导的ARPE-19细胞的存活率,构建氧化损伤模型;CCK-8法检测黑果枸杞多糖对H2O2诱导的ARPE-19细胞的存活率的影响;通过检测细胞内超氧化物气化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MD A)含量变化,揭示黑果枸杞多糖对ARPE-19细胞的抗氧化能力;Hoechst/PI染色并加入caspase抑制剂,观察H2O2诱导后ARPE-19细胞形态;流式细胞仪双染法考察黑果枸杞多糖对H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡情况;免疫印迹法检测正常情况、H2O2诱导和黑果枸杞多糖干预下细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1表达水平的差异。结果:1.本研究中不同产地黑果枸杞基本组成中有显著性差异(P0.05),新疆产地钙、锌含量最高,宁夏产地铁含量最高,青海产地镁含量最高;除丙氨酸以外,其余氨基酸无显著性差异;显微结构上差异主要表现在石细胞和果皮表皮细胞;理化鉴别Rf值、斑点颜色和大小与对照品一致。2.水提醇沉法得到黑果枸杞粗多糖,三氯乙酸法脱蛋白率75.90%,过氧化氢法脱色率为39.90%;DEAE-52纤维素柱分离得到4个组分,Sephadex G-100层析柱纯度鉴定为分子量均匀的单一组分;气相-质谱法分析LMP-1-1单糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖,其摩尔比为1:1.24;LMP-2-1单糖组成为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖,其摩尔比为1.73:1.08:1;LMP-3-1单糖组成为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,其摩尔比为2.20:1:1.07;LMP-4-1单糖组成为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,其摩尔比为1.77:1:1.07。3.CCK-8结果表明,黑果枸杞多糖浓度为25-450μg·mL~(-1)时,细胞存活率与对照组无统计学差异(P0.05),黑果枸杞多糖浓度增高至500μg·mL~(-1)时,细胞活性受抑制;H2O2可以明显降低A RPE-19细胞存活率,H2O2浓度为400μmol·L~(-1)时,ARPE-19细胞半数存活,细胞存活率与对照组有统计学差异(P0.01);黑果枸杞多糖浓度为25-400μg·mL~(-1)时有保护作用,细胞存活率与对照组有统计学差异(P0.01),其中黑果枸杞多糖浓度超过100μg·mL~(-1)时保护作用下降;与模型组对比LMP-2-1组SOD、GSH-Px活力升高,MDA含量下降,检测指标含量与对照组有统计学差异(P0.01);与模型组对比LMP-2-1低、中剂量组不同程度降低ARPE-19的总凋亡率,细胞凋亡率与对照组有统计学差异(P0.05);与空白组对比,模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达增加(P0.05),LMP-2-1低、中剂量组NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达较模型组显著下降(P0.01),高剂量组NLRP3蛋白表达较模型组显著下降(P0.01),IL-1β蛋白表达较模型组下降(P0.05)。结论:1.本研究中不同产地黑果枸杞在基本组成、金属元素含量和性状都有所不同。2.对黑果枸杞多糖进行提取分离纯化,其组成包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖。3.纯化后的黑果枸杞多糖可提高ARPE-19细胞的抗氧化能力,且没有剂量依赖性,可提高H2O2损伤的ARPE-19细胞的SOD、GSH-Px活力,降低MDA含量,并且可能通过下调NLRP3、Caspase-1及IL-1β的蛋白表达,抑制ARPE-19细胞焦亡,进而防治年龄性黄斑病变。


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