收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死疗效评估及活体示踪研究

马翔  
【摘要】: 目的:有关骨髓间充质干细胞(MSC)移植至急性心肌梗死(AMI)组织后的转归及作用机制仍不明确。本包括研究:1)建立猪AMI模型,行心肌直接注射移植自体MSC,观察心功能变化并探讨相关机制;2)探讨应用超强顺磁性铁氧化物(SPIO)标记MSC的条件及方法;3)探讨应用MRI活体示踪SPIO标记的干细胞心肌移植的可行性及有效性;4)探讨经冠状动脉内注射骨髓单个核细胞治疗急性前壁心肌梗死(AMI)的中期临床疗效及安全性。方法:1)本课题第一部分选择10只家猪,体重35~45kg,经导管应用球囊持续封堵前降支动脉血管,建立急性心肌梗死动物模型。将成功建立模型的9只动物随机分为2组:实验组5只动物取骨髓血,分离MSC,体外培养扩增,建立模型2周后通过心肌注射的方法将自体骨髓MSC(1.25×10~6~7.54×10~6)移植至AMI区及交界区;对照组动物注射等量生理盐水。移植后行经胸超声检查观察心脏局部与整体心功能变化;心肌核素灌注显像检查评估左心室心肌缺血节段的改善;HE染色观察心肌组织坏死及修复变化;Van-Gieson染色观察心肌梗死后纤维组织增生情况;免疫组化检测心脏结蛋白(Desmin)、心脏连接蛋白(Connexin-43)和心肌早期转录蛋白(GATA-4)的表达;2)本课题第二部分选择8只家猪,体重35~45kg,经导管应用球囊封堵前降支动脉建立心肌梗死模型。成功建立模型的7只动物随机分为2组:SPIO标记的MSC移植组(n=4),未行SPIO标记的对照组(n=3)。使用Feridex I.V溶液、FeridexI.V.-脂质体混合物及Feridex I.V.-聚赖氨酸混合物分别标记MSC,按25μg SPIO加入1ml的DMEM培养24h,使细胞终浓度为(5~9)×10~6/ml,显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色测定细胞活力,普鲁士蓝染色观察SPIO与细胞的结合。以流式细胞仪检测CD44、CD106在原代、第4代、第6代的MSC的表达。建立模型2周后开胸,在梗死区中央及梗死边缘区共5个点注射移植注射细胞(3.6×10~6~9.4×10~6)。于移植前、移植后1h、2周及4周,使用1.5T核磁影像机行心脏MRI检查,观察梗死区中央及梗死边缘区的细胞移植区有无低信号改变。移植后4周,处死实验动物,取心脏组织行HE染色观察心肌组织坏死及修复;普鲁士蓝染色观察移植区有无SPIO标记的MSC的表达;心肌组织荧光免疫组化检测心脏结蛋白、心脏连接蛋白和心肌早期转录蛋白的表达;行扫描电镜及投射电镜观察SPIO在MSCs表面和细胞内的表达;3)课题第三部分选择8例急性前壁心肌梗死患者,在接受标准药物治疗和介入治疗基础上,经皮冠状动脉内介入治疗后应用Over-the-Wire(OTW)球囊将自体骨髓单个核细胞注入冠状动脉前降支血管,定位以PCI时植入的支架为参考依据。移植前及移植后行经胸心脏超声心动图,测定左心室收缩功能及整体左心室射血分数;行~(99m)Tc-MIBI心肌核素灌注及代谢显像,计算存活及坏死心肌的面积。术后所有患者均进入监护病房持续监护24小时,临床随访时间至少6个月,随访观察心血管事件及不良事件的发生。结果:1)在建立心肌梗死模型中,1只动物发生顽固性室颤死亡,9只动物成功建立心肌梗死模型并成功移植BMCS,建立模型成功率为90%。建立心肌梗死后9例动物行心肌核素显像示左室心尖部及近室间隔部灌注缺损。MSCs移植后4周,核素心肌显像提示对照组仍显示前壁、心尖部灌注缺损,与生理盐水注射前无变化;而心肌注射骨髓干细胞4周后,核素心肌显像提示前壁、心尖部灌注缺损比注射前明显减少。与干细胞移植前相比,实验组室间隔及心室前壁变薄不明显,左室梗死区室壁厚度(IWT)为(4.6±0.3 VS 4.2±0.2,t=2.769,P<0.05),室壁运动趋于正常(8.0±0.3 VS 7.4±0.4,t=2.982,P<0.05),LVEF增高(66.4±6.1 VS 60.0±3.8,t=1.988,P<0.05)。对照组移植后与移植前比较,IWMVs减小,心肌梗死局部室壁变薄,EF减低。移植后实验组IWMVs高于对照组(8.0±0.3 VS 6.9±0.2,t=6.315,P<0.05),IWT较对照组增加(4.6±0.3 VS 3.9±0.2,t=4.919,P<0.05),EF改善(66.4±6.1 VS 54.0±1.4,t=3.926,P<0.05)。由此可见骨髓间充质干细胞移植可以改善梗死心脏的局部与整体心功能。免疫组化检查结果提示在移植区域可见心肌结蛋白、Connexin蛋白和GATA-4表达的阳性细胞,提示MSC植入心肌后可以长期存活并分化成为具有心肌细胞功能的细胞;病理检查发现移植区内有核大胞浆小的移植细胞,提示注射至心肌梗死区的MSC处于分化阶段;2)在建立心肌梗死模型后,MRI检查显示7只动物前壁及心尖部均有灌注缺损区,延迟显像强化,提示心肌梗死模型成功建立。经过24h体外标记,各标记组均可见SPIO与骨髓间充质干细胞结合。三个标记组中SPIO 24小时标记效率均高于90%,SPIO-PLL混合溶液标记MSC的有效率最高,达(95.5±8.2)%。SPIO.-PLL混合溶液标记的细胞存活率(94.7±3.2)%优于SPIO-LFA组(87.5±4.0)%,(P<0.05)及SPIO组(86.6±6.1)%(P<0.05)。SPIO-PLL混合溶液标记的MSC的存活率在标记前是(95.7±3.6)%,标记后为(94.7±3.2)%,P>0.05,二者差异无统计学意义。经含铁血黄素染色后,三个标记组中与SPIO颗粒结合的细胞胞核染成红色,胞浆中可见大小不一的蓝绿色颗粒。扫描电镜检测发现SPIO标记的骨髓MSCs表面有均匀分布的颗粒状物质,投射电镜发现SPIO标记组细胞浆内大量黑色含铁小体,细胞表面可见小针样铁颗粒。采用猪全骨髓细胞贴壁分离法筛选MSC,在培养4代后CD44,CD106的表达均为阳性,表明可以获得纯化的MSC群体。开胸心肌移植后1h,SPIO标记的干细胞移植组中4只动物(100%)MSC移植区在磁共振上呈明显的低信号改变,移植后2周4只动物(100%)MRI呈明显的低信号改变,术后4周示3只动物(75%)细胞移植区有低信号改变。大体标本可见心尖部梗死区室壁明显变薄,SPIO标记组移植部位可见暗褐色移植物。普鲁士蓝染色检查发现在移植后4周与SPIO注射部位对应的组织染色阳性,提示SPIO标记的MSC移植入心肌4周后仍在心肌组织内存活;心肌组织荧光免疫组化检测心脏结蛋白、心脏连接蛋白和心肌早期转录蛋白均有表达,提示移植的MSC在心肌移植区内分化为具有心肌功能的细胞;3)8例前壁急性心肌梗死患者骨髓单个核细胞冠脉内移植均成功,术中、术后无严重并发症。所有患者在骨髓单个核细胞移植过程中及移植术后均无不适主诉,血压,心率均无明显变化。移植后患者LVEF 1个月时为(48.1±10.0)%,与术前相比未见明显变化(43.7±5.8)%,P>0.05;3个月时为52.6±10.0,(P>0.05),移植后12月为(56.2±9.5)%,与术前相比有改善,但是无统计学差异(P>0.05)。SPECT心脏显像结果表明骨髓单个核细胞移植后缺血心肌节段及梗死心肌节段数明显减少。至最后一次随访时,患者缺血心肌改善1个节段以上7例(87.5%),无改善1例(12.5%),缺血增0例(0%)。患者术后6个月6分钟步行实验结果为(412.3±73.8)m,较移植术前明显改善(379.4±80.6),P<0.05。8例患者随访2~23个月均无心悸感觉,心电图及24h动态心电图未发现恶性心律失常,无一例发生死亡、再次心肌梗死、心衰加重再次就诊等心血管事件。无一例患者发生新发肿瘤、支架内再狭窄、支架内血栓等不良事件。结论:1)通过球囊封堵冠状动脉血管建立猪急性心肌梗死模型,建模效率高,建模中应用缺血预处理及药物减少心律失常的发生,为MSCs移植治疗研究提供了良好的实验模型;2)通过心肌直接注射移植家猪自体骨髓MSC,在移植区可见检测心肌细胞结蛋白、Connexin蛋白和GATA-4的表达阳性细胞,提示MSC植入心肌梗死区后可以存活并分化为具有新生心肌功能的细胞;3)MSCs心肌注射移植可以改善心肌梗死后心脏局部与整体心功能,增加梗死区室壁厚度,改善梗死部位室壁运动;4)SPIO标记的干细胞在MRI上呈低信号改变,在心肌移植后4周仍可以被MRI检出,提示应用MRI技术活体示踪动态观察移植的MSC是可行有效的;5)应用SPIO、SPIO-脂质体、SPIO-多聚赖氨酸等经过24h体外标记MSCs,均可以与骨髓间充质干细胞有效结合,标记率均大于90%,细胞活力及形态未受影响,表明SPIO是一种安全、高效的细胞标记物;6)中期随访提示骨髓单个核细胞移植可以抑制急性前壁心肌梗死后左室腔的扩大,提高左室射血分数,改善心肌梗死后左心室心肌缺血,并发症少、安全性好。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 袁方;治疗心肌局部缺血的新方法及护理[J];国外医学.护理学分册;1999年06期
2 刘建勋,徐立,尚晓泓,李连达,周正质,郭萍;地奥心血康对犬心肌缺血及血流动力学的影响[J];中国新药与临床杂志;1994年03期
3 陈杰,赵民,张立藩,郑军;心肌局部缺血对瞬时收缩末压力-容积线的斜率T-E_(max)的影响[J];第四军医大学学报;1990年05期
4 郝卫亚,李为慧,白净;左心室心肌局部缺血的生物力学模型及计算机仿真研究[J];航天医学与医学工程;2001年05期
5 Priya TYAGI,Girish TAYAL;心肌局部缺血的预适应(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2002年10期
6 李艾宁,刘向群;减慢心率药物的应用前景[J];心血管病学进展;2000年05期
7 马新亮,李亮,赵荣瑞,孙本韬;兔心肌局部缺血和缺氧时的电活动与超微结构的变化[J];生理学报;1983年04期
8 罗圣庆;急性心肌梗塞与不稳定性心绞痛患者的血清镍浓度[J];环境与职业医学;1987年03期
9 唐细兰;各种钙拮抗剂的介绍[J];广东药学;1995年01期
10 申露;他汀类药物/β-阻断剂对某些C-反应蛋白水平的影响[J];中华医学信息导报;2003年07期
11 王明明;β阻滞剂治疗心肌梗塞的疗效[J];西北国防医学杂志;1984年02期
12 宁在兰;冠心病的饮食治疗[J];山东食品科技;2002年10期
13 ;~(99m)Tc-硝基咪唑(BMS181321):一种用于探测心肌局部[J];国外医学.放射医学核医学分册;1996年02期
14 ;WHO《Signal》药物不良反应选载(5)[J];药物流行病学杂志;2001年01期
15 王英娥;室性早搏后ST-T改变的心电图分析[J];福建医药杂志;2003年05期
16 胡伟国,王肖龙,金惠根,陈万春;冠心病患者运动试验心电图QT及QTc离散度变化[J];上海医学;1997年05期
17 刘世春;发生疾病的时间规律[J];家庭医学;1996年14期
18 Ronen Jaffe M D ,Doron Zahger ,M D ,高琳;骨牌原理(多米勒效应)[J];江汉大学学报(医学版);1998年03期
19 刘金祥;心性变态反应56例[J];临床荟萃;1998年19期
20 ;不稳定型心绞痛123I-BMIPP显像:一介入对策的指南[J];心血管病学进展;1998年04期
中国重要会议论文全文数据库 前4条
1 刘建勋;徐立;尚晓泓;李连达;周正质;郭萍;;地奥心血康对犬心肌缺血及血流动力学的影响[A];心脑病药物临床评价专家谈[C];1998年
2 邢忠;韩颖;朱俊英;李柏英;;急性心肌梗塞患者血液流变学测定与临床应用的探讨[A];迎接新世纪——2000年全国微循环与血液流变学学术研讨会论文汇编[C];2000年
3 房晶萍;线利波;巨丹;;58例急性心肌梗塞患者血液流变学结果的临床分析[A];2003年全国微循环与血液流变学学术研讨会论文汇编[C];2003年
4 陈岂页;;132例QTd,QTcd临床分析[A];第三届心脏学会、第六届心功能学会及心功能杂志创刊10周年学术会议论文摘要[C];1996年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 张涛;遗传性长QT间期综合征基因突变数据库的建立和对10个心律失常中国人家系致病基因的筛查[D];浙江大学;2010年
2 王洁;心肌细胞自噬在创伤后迟发性心脏损伤中的作用研究[D];山西医科大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马玉林;二维斑点追踪技术对原发性高血压患者心肌应变的研究[D];河北医科大学;2012年
2 陈倩;间隔心肌化学消融术对肥厚型梗阻性心肌病心脏电生理影响临床研究[D];大连医科大学;2012年
3 唐特;联合检测心肌营养素-1与脑钠肽对心源性呼吸困难的诊断价值[D];中南大学;2010年
4 何丹青;二维斑点追踪技术评价冠心病患者冠状动脉搭桥前后左心功能变化[D];安徽医科大学;2013年
5 何丽;七味三芎汤对动脉粥样硬化大鼠TNF-α和IL-6的影响[D];陕西中医学院;2010年
6 刘凌凌;中西医结合干预AMI直接PCI患者QTd、Tp-Te、fQRS的临床研究[D];广州中医药大学;2013年
7 许爱斌;内皮祖细胞移植对兔心肌梗死后心功能的影响[D];第四军医大学;2009年
8 龙滨;健康比格犬心脏起搏状态左心室应变综合向量的超声研究[D];川北医学院;2011年
9 陈彦玲;组织多普勒成像对糖尿病及其合并高血压患者的心肌评估[D];天津医科大学;2009年
10 胡艳兵;斑点追踪成像技术评价蒽环类化疗药物对乳腺癌患者心功能的影响[D];吉林大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 解放军总医院心血管内科 衣淑华 刘国树;治疗缺血性心脏病新药[N];中国高新技术产业导报;2001年
2 张骁束梅英;偏头痛逢新对手[N];中国医药报;2003年
3 冯友根;治疗偏头痛新药夫罗曲坦[N];中国医药报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978