新疆维吾尔族乙型肝炎病毒基因型分布、准种特性及其生物学意义研究

【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重威胁人类健康的传染性疾病,同时也是严重的公共卫生问题之一。HBV感染可导致多种形式的急慢性肝病,目前已明确,HBV是引起慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌的重要病因之一。 HBV基因组具有异质性特点是生存进化的必然结果,是适应生存环境的必然需求。HBV基因型和准种是其异质性的具体体现。 HBV基因型是HBV重要的生物学特性。到目前为止,根据HBV全基因组序列异质性≥8%的原则,HBV可分为A、B、C、D、E、F、G、H8种基因型。研究提示,HBV在全球的分布具有显著的地域分布特点和种族分布特异性。A型主要分布于欧洲、非洲、美国和亚洲国家;B型主要分布于中国大陆、中国香港、印度尼西亚和日本等亚洲国家和地区;C型主要分布于东南亚国家、日本、韩国、孟加拉国和中国等远东亚洲国家;D型主要分布于中东地区;E型仅见于西部非洲;F、G型主要分布于中美洲、南美洲地区;H型是新发现基因型,主要在中美洲和南美洲,分布仍需进一步调查。我国的研究显示中国HBV主要以B、C型为主。 准种是体内HBV的存在形式。基因变异是物种进化中经常发生的遗传事件。对HBV而言,核酸的突变则造成体内同时存有基因序列有微小差别的种群,种群的各个成员之间,其差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2%～5%(通常以4%界定),这种差别不足以构成病原体不同的基因型或血清型,但又的确存在着基因序列的差别,这种现象就称为准种(quasispecies)。研究准种具有重要的临床意义,主要表现在:对抗HBV治疗药物的影响;机体的免疫压力以及抗病毒药物的选择压力在HBV准种形成过程中的地位和作用;HBV准种的形成与急性HBV感染的慢性化;慢性HBV感染的临床转归等方面。 HBV基因型和准种特性的研究将有助于对HBV的临床转归、HBV抗病毒疗效、HBV基因突变特点等问题的再认识和研究的深入,对研究HBV的生物学特性具有重要意义。 我国为多民族国家,特别是新疆地处祖国西北,多民族聚居,各民族HBV感染者HBV的生物学特性(HBV基因型、准种)有无差异,此种差异如何及与临床的关系值得研究。 目的:本研究初步探讨新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布特点及其与临床的关系。通过研究可完善我国不同民族HBV基因型分布资料库,丰富HBV分子流行病学的内容,可以更好地指导临床上抗病毒药物的选择和使用。其次,更深入和全面地了解HBV的生物学特性,探讨HBV-RT区准种特性以及抗病毒治疗(拉米夫定)对准种的影响,深刻揭示准种特性及其生物学意义,这具有重要的理论意义和实践意义。课题主要进行了三方面研究:1)新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布特点及其与临床的关系;2)新疆维吾尔族慢性乙肝患者基因D型HBV株的全基因克隆化研究;3)新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV-RT区准种特性及其生物学意义研究。 方法:1)选择127例维吾尔族慢性乙肝患者为主要研究对象,诊断符合我国2005年“病毒性肝炎防治方案”标准。共采集127份血清,-20℃冻存备用。采用基因型特异性引物巢式PCR法进行基因分型,并对部分标本测序验证。采用生物信息学软件进行分析。统计学处理应用SPSS12.0版本统计分析软件进行率的比较(x~2检验);2)应用分子克隆技术和生物信息学技术对1例维吾尔族HBV基因D型病毒株进行全基因克隆化研究;3)选择5例维吾尔族慢性HBV感染者为主要研究对象,选择HBV RT区为研究靶区。其中慢性乙肝患者4例,另1例为肝炎肝硬化(代偿期)患者;2例为接受拉米夫定治疗停药后复发的病例,3例为未接受抗病毒治疗的患者;基因D型3例,基因B型2例。均来自新疆医科大学第一附属医院感染科。诊断符合我国2005年“病毒性肝炎防治方案”标准。采集血清,-20℃冻存。采用克隆-测序和构象敏感凝胶电泳(CSGE)方法进行准种研究。并进行生物信息学分析和临床分析。 结果:1)初步探讨新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布及其特点。结果显示,基因D型占39.4%(50/127),基因B型占22.0%(28/127),基因C型占16.5%(21/127),基因B+D混合型占9.5%(12/127),基因C+D混合型占8.7%(11/127),基因B+C+D混合型占3.9%(5/127);HBeAg阳性与HBeAg阴性的维吾尔族慢性乙肝患者基因型分布比较无统计学的差异(x~2=6.033,P=0.303);不同年龄维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布并无统计学的差异(x~2=3.137,P=0.679);不同性别维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型分布亦无统计学的差异(x~2=8.058,P=0.623)。初步研究提示,新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型以D型占优势,其次可见B、C型及B+D、C+D、B+C+D混合型。同一疾病谱的慢性HBV感染者基因型分布可能与宿主HBeAg状态、年龄、性别无明显相关;2)应用分子克隆技术和生物信息学技术对1例维吾尔族HBV基因D型病毒株进行全基因克隆化研究。获得了我国首例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列(已在GenBank上注册)。结果显示,其基因组全长为3174bp,与目前D基因型参照序列比较同源性约为92%～98%,与一株来自中国的DC重组基因型(AY862865)比较同源性约为91%。进一步分析发现,该新疆病毒株与目前D基因型参照序列比较有9个碱基的缺失(位于核苷酸1760-1768位,ATT AAA GGT),即发生了缺失突变。该新疆株HBV血清型为ayw2,与中国首例D基因型病毒株(GenBank Accession Number:AF280817)的ayw3血清型不同,说明新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株依然有其自身特点。重组位点分析,该新疆病毒株未发生与其他基因型的重组。系统进化树分析,该新疆株与两株来自土耳其的HBV株(AY796032和AY721605)遗传距离最近;3)对准种的研究显示,治疗的患者(拉米夫定)HBV准种复杂性似要高于未治疗者,未经药物选择下HBV准种组成相对较单一。治疗和未治疗患者HBV的优势克隆均发生了rtA222T(A,丙氨酸;T,苏氨酸)突变,rtA222T突变是一较少见的突变形式。HBV准种群会发生漂变,即病情重时其准种复杂性低,病情好转时复杂性上升。 结论:1)初步研究提示,新疆维吾尔族慢性乙肝患者HBV基因型以D型占优势,D型为优势基因型;其次可见B、C型及B+D、C+D、B+C+D混合型。与我国主要流行的HBV基因B型和C型的分布有显著地域和种族差别。同一疾病谱的慢性HBV感染者基因型分布可能与宿主HBeAg状态、年龄、性别无明显相关;2)通过HBV全基因克隆化研究,获得我国首例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列(在GenBank上注册)。其基因组全长为3174bp,该新疆病毒株与目前D基因型参照序列比较有9个碱基的缺失(位于核苷酸1760-1768位,ATT AAA GGT)。其血清型为ayw2。重组位点分析,该新疆病毒株未发生与其他基因型的重组。进化树分析发现,该新疆株与两株来自土耳其的HBV株(AY796032和AY721605)遗传距离最近。新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株依然有其自身特点;3)新疆维吾尔族慢性HBV感染者的HBV RT区基因序列准种研究显示,治疗患者(拉米夫定)HBV准种复杂性似要高于未治疗者,未经药物选择下HBV准种组成相对较单一。准种组成与是否抗病毒治疗可能相关,且相互影响。治疗和未治疗患者HBV的优势克隆均发生了rtA222T(A,丙氨酸:T,苏氨酸)突变,rtA222T突变是一较少见的突变形式。HBV准种群会发生漂变,即病情重时其准种复杂性低,病情好转时复杂性上升。准种群漂变与疾病转归可能相关。