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新疆乙型肝炎病毒的基因亚型、变异的研究

孙晓风  
【摘要】: HBV是环境中存在的一种对人致病性较强的病毒。HBV感染后常可引起急性和慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌,是中国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。慢性肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行。我国属HBV感染高流行区。 HBV具有易变性及准种的特性。目前,根据HBV全基因组序列差异≥8%或S基因序列≥4%,将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型。HBV基因型有明确的地理和人种的分布特征。HBV在慢性感染过程中,变异可自发产生,也可在体内因宿主免疫压力或药物压力下而产生。如慢性乙型肝炎可因前C区变异和/或C区基因变异,不表达HBeAg而分为HBeAg阳性和HBeAg阴性两大类。HBV C基因基本核心基因启动子变异(BCP)和前C区变异(PC),可能与肝病严重程度有关。也具有一定的地域分布差别。HBV聚合酶有四个功能区,其中RT区有7个催化功能的基序,依次称为G、F、A、B、C、D、E区,其中,B、C、D区是P基因耐药变异最常见的部位。不同的核苷类似物耐药株的变异位点不同。 新疆是个多民族居聚区,HBV感染及疾病谱有其特殊性。研究表明,新疆维吾尔族HBV基因型以D基因型为多,与我国内地以B、C基因型为主的流行情况有所不同,为进一步证实新疆地区的不同民族HBV感染者的基因型分布特征,了解新疆不同民族的基因亚型的分布,前C区变异和C区变异,耐药变异等情况,为今后防治HBV奠定了理论的基础。目的:进一步证实新疆慢性HBV感染者的HBV基因型分布特征,了解新疆不同民族的基因亚型,PC、BCP变异及耐药变异的特征,为进一步研究防治HBV提供科学依据。尤其是研究新疆HBV感染者基因型、亚型分布有无特征。新疆HBV感染者的HBV PC变异和BCP变异与HBV感染病情严重性和HBeAg阴性有无关联性。了解P基因区变异与HBV不同基因型是否有联系以及抗病毒药物效果与P基因区变异之间的关系,旨在为今后防治HBV感染提供科学依据。 方法: 收集331例新疆慢性HBV感染者的血清,其中慢性乙型肝炎(CHB)240例,乙肝肝硬化(LC)64例,肝癌(HCC)27例。 1)采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,进行基因型、基因亚型、PC变异、BCP变异的检测,并对部分标本用直接测序法进行验证,所得的测序结果采用生物信息学技术进行分析比较。 2)对随机选择的14例标本进行全基因测序,选择14例用核苷类似物治疗的CHB及4例未用核苷类似物的标本进行P基因区测序,然后用生物信息学技术进行分析并与基因库进行比对分析。 结果: 1)用PCR-RFLP技术对新疆331例HBV感染者的HBV基因型、基因亚型进行检测,随机选取部分标本用直接测序法验证。结果显示331例慢性HBV感染者的HBV基因型为:B基因型12.7%,C基因型64%,C/D重组体16%,D基因型7.3%。进一步检测基因亚型显示B基因亚型均为Ba亚型,未检测到Bj亚型。在C基因型中,C1亚型42.9%,C2亚型57.1%。不同民族基因型分析显示,在汉族HBV感染者中,B基因型14.9%,C基因型72.9%,C/D重组体9.5%,D基因型2.7%,而维吾尔族HBV感染者中B基因型8.3%,C基因型45.9%,C/D重组体29.4%,D基因型16.5%。维吾尔族与汉族比较,基因型分布有差别(P0.05)。进一步基因亚型结果显示Ba亚型中,汉族78.6%,维吾尔族21.4%。C基因亚型汉族76.4%,其中,C1亚型39.5%,C2亚型60.5%;而维吾尔族23.6%,C1亚型54%,C2亚型46%。在不同临床类型中,慢性乙型肝炎中,C1亚型26.7%,C2亚型33.3%。在乙肝肝硬化中,C1亚型30%,C2亚型45.3%。在肝癌中,C1亚型30.8%;C2亚型46.2%。 2)用PCR-RFLP技术检测HBV PC变异和BCP变异结果显示,PC变异30.2%,BCP变异34.4%。进一步比较PC变异和BCP变异,在不同亚型分布显示,Ba亚型中PC变异35.7%,BCP变异28.6%;C1亚型中PC变异37.4%,BCP变异41.8%;C2亚型PC变异25.6%,BCP变异31.4%;C/D重组体PC变异20.8%,BCP变异35.8%。C1亚型BCP变异明显高于Ba亚型,有统计学意义(P0.05),PC变异在各亚型中无明显差别(P0.05)。维吾尔族HBV感染者中,Ba亚型PC变异1.8%,BCP变异5.5%;C1亚型PC变异3.7%,BCP变异11%;C2亚型PC变异5.5%,BCP变异7.3%;C/D重组体PC变异6.4%,BCP变异12.8%,C/D重组体的PC变异、BCP变异明显高于Ba亚型,差异有统计学意义(P0.01)。C1亚型、C2亚型介于两者之间。 3)使用PCR-RFLP技术对HBV PCR-测序方法,对14例病人进行全基因的测序。全基因测序证实2例C/D重组体,12例D基因型与RFLP方法保持一致。测序结果显示2例C/D重组体,12例D基因型与GenBank现有的序列有差异。全部在GenBank上收录。4)用PCR-测序方法,对新疆18例HBV感染者的HBV P基因区测序,采用 生物信息学技术进行分析,在P基因区变异结果显示,14例服用阿德福韦治疗,CHB标本中有13例出现P基因区变异。进一步分析显示,主要在聚合酶B区附近的变异(16个)和D区(6个)附近。 5例C1亚型在聚合酶B区附近的变异有9个;聚合酶D区附近的变异有1个。5例C2亚型在聚合酶B区附近的变异有3个;聚合酶D区附近的变异有3个。6例Ba亚型在聚合酶B区附近的变异有4个;聚合酶D区附近的变异有8个。1例D基因型在聚合酶B区附近的变异有3个;聚合酶D区附近的变异有1个。1例C/D1亚型在聚合酶B区附近的变异2个。34例YMDD变异中,B基因型11.8%,C基因型64.7%,C/D基因型20.6%例,D基因型2.9%,提示C基因型易出现YMDD耐药变异。在基因亚型中,10例C1亚型45.4%,12例C2亚型54.5%,YMDD变异在C2亚型比C1亚型的多。 结论: 1)新疆地区331例HBV感染者的HBV采用PCR-RFLP方法,部分标本测序验证,采用生物信息学技术进行分析,结果显示新疆HBV基因型以C基因型为主,且以C2亚型为主。汉族HBV基因型以C基因型为主,且以C2亚型为主;维吾尔族HBV基因型以C基因型、C/D重组体为多,且以C1基因亚型为多。汉族C2基因型明显高于维吾尔族,而维吾尔族C/D重组体、D基因型明显高于汉族。在新疆地区,HBV基因型中依次为C基因型C/D重组体B基因型D基因型;汉族基因型依次为C基因型B基因型C/D重组体D基因型;维吾尔族基因型依次为C基因型C/D重组体D基因型B基因型。C基因亚型汉族中C2亚型C1亚型,维吾尔族中C1亚型C2亚型。在乙肝肝硬化、肝癌中,C2所占亚型比例明显高于慢性乙型肝炎C2亚型的比例,有统计学意义(P0.05),在肝癌中C2亚型明显高于C1亚型。 2)对新疆331份HBV感染的血清进行HBV PC、BCP变异研究结果显示,C1亚型BCP变异明显高于Ba亚型,PC变异在各亚型中无明显差别。Ba亚型BCP变异发生率最低,C/D重组体PC变异发生率最低。说明HBV不同的亚型之间存在PC、BCP变异的差异。维吾尔族HBV感染者C/D重组体的PC变异、BCP变异明显高于Ba亚型,差异有统计学意义(P0.01)。C1亚型、C2亚型介于两者之间。在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、肝癌中,HCC组的PC变异和BCP变异明显高于CH、LC组。 3)对新疆14例HBV感染的HBV全序测序,在新疆首次经过以上方法,首次报道出一种新的基因型,命名为C/D重组体。维吾尔族中的C/D重组体所占比例高于汉族C/D重组体的比例。,说明C/D重组体存在族别的差异。已在GenBank上注册。 4)对新疆18例P基因区变异位点进行分析。14例用阿德福韦治疗,13例出现变异,主要集中在聚合酶B区和D区附近。而且口服核苷类似物,随着时间的延长,出现HBV P基因变异的可能性增加;C1亚型变异主要集中在聚合酶B区附近,Ba亚型变异主要集中在聚合酶D区附近。YMDD变异的C2亚型比C1亚型的比例高,这方面的研究还需要更多实验证实。C1亚型变异主要集中在聚合酶B区附近,Ba亚型变异主要集中在聚合酶D区附近。


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