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大鼠体内游离棉酚含量检测方法学研究

栾姝  
【摘要】:目的:建立棉籽仁和大鼠血浆中游离棉酚(FG)含量HPLC检测方法以及大鼠血浆、肝脏和肌肉组织中游离棉酚含量的HPLC-MS检测方法。方法:HPLC法测定棉籽仁和大鼠血浆中游离棉酚的含量:采用色谱柱ODS-C18(4.6 mm×200 mm,5μm),柱温25℃,流动相为甲醇-1%磷酸水溶液(85:15,V/V),流速1.0 mL/min,检测波长235 nm;HPLC-MS法检测大鼠血浆、肝脏以及肌肉组织中游离棉酚含量:以丙酮作为样品的提取剂和沉淀剂,经过涡旋、离心,取上清液吹干,甲醇溶解再次涡旋、离心,进一步除去干扰物质,0.45μm微孔滤膜过滤,进样测定,采用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm,5μm),柱温25℃,测定血浆所用流动相为乙腈-1%甲酸水溶液(80:20,V/V),测定肝脏及肌肉组织所用流动相为甲醇-1%甲酸水溶液(85:15,V/V),流速0.2 mL/min,以甘草次酸为内标,样品通过电喷雾电离源(ESI)离子化后采用选择性离子监测(SIM)方式测定,棉酚的检测离子为[M-H]- m/z 517.2,甘草次酸的检测离子为[M-H]- m/z 469.3。结果:1. HPLC法检测棉籽仁中游离棉酚含量:游离棉酚浓度在1.90~35.00μg/mL范围内线性关系良好,r = 0.999 6,高、中、低三个浓度的加样回收率为98.6%~100.4%,12种棉籽仁样品中游离棉酚的含量为0.60%~1.20%。2. HPLC法检测大鼠血浆中游离棉酚含量:血浆棉酚在0.33~3.30μg/mL范围内线性关系良好,r = 0.999 4,检测限为0.04μg/mL(S/N = 3),高、中、低三个浓度的平均加样回收率为94.7%~97.3%,给药组大鼠血浆中游离棉酚的含量为0.68~2.14μg/mL。3. HPLC-MS法测定大鼠血浆、肝脏、肌肉组织中游离棉酚含量:血浆棉酚在0.075~7.500μg/mL范围内呈良好线性,r = 0.998 2,检测限为5 ng/mL,高、中、低三个浓度的平均加样回收率为93.3%~97.2%,给药大鼠血浆中棉酚的含量为0.28~1.05μg/mL;肝脏棉酚在0.61~61.58μg/g范围内呈良好线性,r = 0.999 0,检测限为10 ng/g,高、中、低三个浓度的平均加样回收率为92.8%~98.0%,给药组大鼠肝脏中棉酚的含量为3.09~6.38μg/mL;肌肉组织棉酚在0.03~4.12μg/g范围内呈良好线性,r = 0.999 2,检测限为2 ng/g,高、中、低三个浓度的平均加样回收率为92.5%~98.3%。结论:本课题所建立的大鼠体内游离棉酚含量的检测方法具有良好的灵敏度、准确度、精密度和专属性,并且样品的处理方法简捷快速,适于生物样品中游离棉酚的检测,该检测方法的建立,将为动物源性食品中游离棉酚含量的检测标准提供参考。


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