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石油污染土壤中烷烃降解菌的分离鉴定及降解特性

朱杰  
【摘要】:本研究以正十六烷为唯一碳源,从长期受石油污染土壤样品的富集样品中分离筛选出14株隶属于9个不同属的菌株,其中编号为LAM1007的菌株在复筛过程中表现出最高的降解效率,因此,后续以菌株LAM1007为研究对象通过单因素实验研究了环境因素(温度、p H、接种量和转速)对菌株降解效率的影响,以及不同初始浓度的正十六烷(0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,v/v)对菌株降解效率的影响。同时,本实验也初步研究了该菌株对高浓度的柴油(2.0%,体积比)及液体石蜡(0.3%,v/v)样品中各烷烃组分降解能力进行初步评估。基于该菌株具有较强的烷烃降解能力,本研究对菌株LAM1007的功能基因alk B进行了克隆及表达,并对重组烷烃单加氧酶基因alk B的表达条件进行了初步研究,以期为后续基因工程菌的应用及酶学特性的研究奠定基础。对菌株LAM1007的16S rRNA基因序列分析后,结果表明该菌株与不动杆菌属(Acinetobacter)内的有效发表种最高相似度分别为98.8%,97.0%,初步判断其为不动杆菌属的疑似新种,因此对其进一步进行了系统分类学研究。并对另外一株编号为LAM-WHM-D11的Arenimonas属的菌株也同时进行了系统分类学研究。主要结论为:首先,以正十六烷为唯一碳源从石油污染样品的富集样品中分离筛选出14株分别隶属于布鲁氏菌属(Brucella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水杆菌属(Aquabacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Spingopyxis属、Kosakonia属、戈登氏菌属(Gordonia)及铁矿沙单孢菌属(Arenimonas)的烷烃降解解菌。其次,实验中对菌株LAM1007降解正十六烷的特性进行了初步研究,结果表明该菌株在正十六烷无机盐培养基中的最适降解条件为:30°C,p H 7.0,接种量1%(v/v),转速180 r/min,在该条件下浓度为0.3%(v/v)即2310.4 mg/L的正十六烷60 h内降解率高达90%,并且对于浓度高达2.0%(v/v)的正十六烷在相同时间内降解率仍能达53%。同时,菌株LAM1007经16S r RNA基因序列分析发现其与Acinetobacter junii LMG998T相似度最高为98.8%,与Acinetobacter venetianus LMG 19082T相似度为97.0%,并依据其菌落形态特征初步确定其为不动杆菌属(Acinetobacter)等结果的表明其为Acinetobacter一株疑似新种。而菌株LAM-WHM-D11经过多相分类学研究结果表明:该菌株是一株能生长于浓度为0.3%(v/v)正十六烷无机盐培养基并能耐受一定浓度的重金属离子,归属于Arenimonas属的一株新种。并且,以柴油为唯一碳源的无机盐培养基中,菌株LAM1007对于柴油降解特性的研究结果表明,菌株LAM1007对于柴油中烷烃组分C_(13)-C_(19)具有显著降解作用,尤其是C16降解效果更为显著,在降解液体石蜡也表现出相同的规律,结果表明菌株对于石蜡中烷烃组分C_(13)-C_(18)降解效果明显,尤其对于C_(16)的降解效果最明显。这更进一步说明该菌株在选择底物利用时更偏向选取C_(16)为降解底物。最终,通过引物设计,成功扩增了alkB功能基因并成功构建了E.coli BL21/pET28a-alk B表达菌株。重组alk B的表达条件的结果表明其在37°C,30°C及25°C条件下,IPTG浓度为0.1-1.0 mM时均未获得可溶蛋白AlkB表达,而当温度为16°C条件下,IPTG浓度在0.1-1.0 mM时可溶性蛋白AlkB表达,但在含量上却无明显差异。


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