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山东地区啮齿类动物病毒宏基因组研究

刘蒙蒙  
【摘要】:研究目的和意义:啮齿类动物作为多种病毒的天然储备库,尤其是鼠类不仅与人类接触密切而且还是多种病毒的传染源。本研究掌握山东地区啮齿类动物肠道内容物和组织病毒组成,目的在于了解具有潜在致病性病毒和新型病毒,有利于快速应对因这些病毒引起的突发病毒性公共卫生事件;发现与鉴定新型病毒为可能的跨宿主传播提供预警信息,更新啮齿类动物所携带病毒的宿主种类和地理范围,丰富了啮齿类动物携带的病毒谱;对发现的新病毒进行基因组结构分析、系统进化分析和流行病学调查,为防治新病毒引起的疾病提供理论支撑。研究方法:收集我国山东省青岛市黄岛区、淄博市淄川区、济宁市嘉祥县三个地区的居民区和野外啮齿动物标本。将210份啮齿类动物肠道内容物标本和241份组织标本分别混合为10个肠道内容物标本库和10个组织标本库,上述20个标本库依次采用过滤、DNA酶消化的方法对标本进行预处理并提取核酸;提取核酸后,送到华大基因科技股份有限公司进行Hiseq高通量测序;利用实验室建立好的生物信息分析平台对测序后的海量数据进行分析,获得肠道内容物和组织的病毒组成;筛选出部分可能对人类或动物具有感染性的病毒进行PCR验证和筛查,了解该病毒在啮齿动物中的流行特征;对潜在的新病毒,包括沙粒病毒科的温州病毒、鼠诺如病毒、札如病毒以及博卡病毒采用PCR方法、walking PCR以及3’和5’RACE等方法扩增病毒全基因组以了解其基因组特点、进化关系等;对温州病毒进行细胞分离、动物感染等实验深入研究其感染性和致病性以掌握该病毒的病原学特征。结果:每个标本库获得5GB的高通量数据,序列经过滤、比对、病毒注释后,肠道内容物标本库S1-S10有1,416,731条序列被注释到病毒,组织标本库T1-T10有57,695条序列被注释到病毒。序列分析后发现肠道内容物标本序列划分为73个科和237个属,包括脊椎动物病毒28个科114个属,植物病毒19个科66个属,无脊椎动物10个科17个属,另外噬菌体16个科40个属;组织标本的序列划分为35个科和78个属,包括脊椎动物病毒18个科44个属,植物病毒8个科22个属,无脊椎动物病毒5个科7个属(这类病毒能同时感染脊椎动物和无脊椎动物,在啮齿类动物宿主中同源性较低),噬菌体4个科5个属。脊椎类动物病毒占比最大,本研究的脊椎动物病毒主要为冠状病毒(24%)、星状病毒(18%)、小双节病毒(17%)、细小病毒(11%)、小RNA病毒(10%)等。在肠道内容物中发现的冠状病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒、腺病毒和博卡病毒以及在组织中发现的温州病毒等,这些病毒常引起动物疾病的流行和暴发,如果存在跨物种传播给人类,可能会对人类的生活及身体健康产生不利的影响。本研究还发现鼠轮状病毒的多个基因型(A、B、D、H),其中A组和B组占比最大,我们扩增获得了B组11个节段的近全基因组序列。针对以上病毒,选择了温州病毒(G107)、诺如病毒(SDHD46)、札如病毒(S-82)和博卡病毒(S9-108)进行全基因组扩增了解其基因组特点。温州病毒G107的L节段基因组全长7,131核苷酸,S节段全长为3,322个核苷酸。L和S节段的核苷酸序列与已知的病毒株相似度分别为84.7%~86.8%和84.2%~87.8%。DH82细胞实验和小鼠感染实验均显示阴性,表明该病毒对这些细胞和动物不敏感,没有感染风险和致病性。获得鼠诺如病毒SDHD46基因组,全长7,382个核苷酸,全基因组核苷酸序列与大部分已知鼠诺如病毒株相似度为76.8%~78.1%。分析SDHD46株VP1不同功能区氨基酸位点突变情况,发现S区只出现1个突变位点,P2区出现11个突变位点(高变区),P1区有5个突变位点。札如病毒S2-82基因组全长为6,841个核苷酸,分析病毒基因组结构特点,而且是目前Gen Bank中啮齿类动物札如病毒的首株全基因组。本研究在鼩鼱和仓鼠宿主内发现博卡病毒株S9-108,获得近全基因组为4,977个核苷酸;另外,博卡病毒株S9-108与已知分离出的6株鼠博卡病毒(宿主为褐家鼠)相似性较低,仅为50.1%,根据国际病毒分类委员会的分类标准,S9-108属于细小病毒科博卡病毒属的一个新种。结论:本研究通过病毒宏基因组学方法深入地了解了我国山东地区啮齿类动物携带的病毒,其种类繁多。发现大量可能对动物和人类致病的病毒以及与已知病毒同源性较低的新型病毒,如温州病毒(新的沙粒病毒)、星状病毒、博卡病毒、鼠诺如病毒和札如病毒等。这些病毒组成极大地丰富了我国及全球野生动物所携带病毒的数据库。


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