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圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

赵晨  
【摘要】:圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是一种典型的产油酵母,能在多种营养元素限制下产油脂,另外还可合成类胡萝卜素。但是作为非模式酵母,圆红冬孢酵母的遗传操作平台还很不成熟。本研究主要在R.toruloides NP11(简称Rt NP11)中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统,为遗传改造提供技术手段。通过农杆菌介导转化法将内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT2(Diacylglycerol acyltransferase)转入Rt NP11菌株中,得到过表达DGAT2的菌株Rt NP11-DGAT2,比较评价细胞油脂含量的变化。在此转化方法基础上,从Rt NP11基因组中克隆RNA聚合酶III启动子U6,从Rt NP11基因组中鉴定tRNA~(Gly)基因,U6与tRNA~(Gly)基因融合形成人工杂合启动子U6-tRNAGly。合成密码子优化的Cas9基因,Cas9表达元件与gRNA转录元件通过Gibson方法连接到质粒框架,以类胡萝卜素合成途径中的关键基因—八氢番茄红素脱氢酶基因CRT1为CRISPR编辑的验证靶点,20 bp的靶基因序列通过PCR扩增引入载体中,构建表达载体并转入Rt NP11,得到重组菌Rt NP11-U6-tRNAGly Target 1;为了提高基因编辑效率,首先改变gRNA启动子,得到重组菌Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 1、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 1和Rt NP11-SCR1-tRNALys-tRNAGly Target 1,其次在CRT1基因上设计新的靶序列Target 2、Target 3,得到重组菌Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 2、Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 3、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 2、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 3、Rt NP11-U6-tRNAGly Target 2和Rt NP11-U6-tRNAGly Target 3,通过表型观察、DNA测序,分析基因突变情况。结果表明农杆菌介导转化技术能够有效转化Rt NP11,过表达DGAT2基因使细胞油脂含量提高50%。Rt NP11被Cas9切割后在切割位点附近存在碱基缺失和碱基增加两种修复模式。gRNA的启动子影响CRISPR/Cas9基因编辑效率,其中SCR1-tRNAGly的编辑效率最高,为20%,而改变靶序列未能提高基因编辑效率。本研究建立的CRISPR/Cas9基因编辑系统为圆红冬孢酵母的高效基因编辑奠定了基础。


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