脐带间充质干细胞联合白藜芦醇对1型糖尿病小鼠肾保护作用的研究

【摘要】：目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN))是糖尿病危害最大的微血管并发症,是引起终末期肾病最主要的原因,且已成为严重威胁人民健康的一种慢性病,治疗花费巨大,给社会带来沉重的负担。目前DN的临床治疗手段并不能从根本上阻止糖尿病肾病的进展和恶化,因此寻找新的有效治疗方法刻不容缓。大量新近研究发现足细胞病在糖尿病肾病的发生发展中起着关键的作用,糖尿病肾病早期病理表现为足细胞数量减少和裂孔隔膜相关蛋白表达下调,由此引发基底膜增厚,滤过膜功能障碍,引起微量白蛋白尿,随病情进展最终造成大量蛋白尿和肾功能衰竭。因此,揭示足细胞损伤的机理,修复足细胞的功能是糖尿病肾病治疗中的一个关键问题。糖尿病不仅是一种高血糖疾病,还是一种慢性的、低度炎症性疾病的观点已被广为接受,持续高血糖启动慢性炎症过程在足细胞损伤中的作用日益引起学者们的关注。白藜芦醇是一种AMPK-SIRT1-PPARα的激活剂,可通过抑制NF-κB的活性发挥强大的抗炎作用,目前在抗肿瘤、抗衰老以及溃疡性结肠炎、糖尿病、阿尔茨海默病、心血管病的防治中已有大量的研究。间充质干细胞(MSCs)是一种多能干细胞,可启动损伤修复,分化为功能性细胞,代替衰退、损伤的细胞;其免疫调节作用可减轻局部组织器官的炎性反应,并可特异性向炎症部位迁移,在一些临床难治疾病如系统性红斑狼疮、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足等方面均有一定探索。脐带间充质干细胞因具有来源丰富、取材方便、免疫原性更低等优点,是目前间充质干细胞最重要的来源。白藜芦醇是否能促进脐带间充质干细胞的免疫调节作用目前尚不明确。因此,本实验选取人脐带间充质干细胞联合白藜芦醇对自发T_1DM的NOD小鼠进行干预,观察小鼠干预后的一般情况、体重、血糖、24小时尿白蛋白排泄率的变化,利用光镜和透射电镜观察小鼠肾脏的形态学变化、足细胞数目。并应用免疫组化染色、western blot等方法测定肾脏MCP-1、RAGE、nephrin、WT1蛋白表达的变化,明确脐带间充质干细胞联合白藜芦醇对肾脏的保护作用,探讨其是否可以减轻肾小球足细胞损伤及其可能的机制。方法:所有脐带组织取自青岛大学附属医院产科健康产妇,传染病相关检测均为阴性。实验动物饲养于青岛大学附属医院SPF级动物实验室。具体方法如下:1.应用组织块贴壁法对hUCMSCs进行分离,传代培养。2.将培养至P3代的hUCMSCs用流式细胞仪进行鉴定。3.实验动物的成模及检测选取健康清洁6-8周龄雌性NOD小鼠,体重20-24g,适应性饲养1周,自第二周始每周1次固定时间(2:00p.m.)称重,尾部针刺取血,用美国强生稳豪血糖仪监测血糖,连续两次随机血糖值≥16.6mmol/L可确诊为1型糖尿病。4.实验分组:成模后的小鼠随机分为5组:NOD-T_1DM组(糖尿病对照组)、INS组(胰岛素对照组)、Res组(白藜芦醇治疗组)、hUCMSCs组(干细胞治疗组)、hUCMSCs+Res组(联合治疗组)。各组小鼠以确诊糖尿病当天记作第1天(0w),称量体重并检测随机血糖,此后分别于第14d、28d、42d、56d(分别记录为2 W、4 W、6 W和8 W)按照之前方法称量体重并检测随机血糖。实验开始后,Res组、hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组均给予小剂量甘精胰岛素以防止小鼠出现严重感染、糖尿病酮症酸中毒。5.标本采集:小鼠确诊1型糖尿病8周后,禁食8-10h,通过内眦取血,测定血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr);留取24小时尿标本测24小时尿白蛋白排泄率(24hUAER);取新鲜肾脏,分别用于PAS染色、免疫组化染色、电镜观察及western blot检测。6.PAS染色光镜下、透射电镜下分别观察肾脏组织病理变化,计数肾小球足细胞数目。7.分别用免疫组化染色、western-blotting检测肾组织MCP-1、RAGE、nephrin、WT1蛋白表达。8.计算24h尿白蛋白排泄率与足细胞计数、MCP-1、RAGE、nephrin、WT1蛋白表达之间的相关关系。9.统计学分析:实验数据采用SPSS 19.0版本进行分析。计量资料以平均数±标准差(x±S)表示,组间差异以单因素方差分析,两两相互比较采用LSD-t检验,方差不齐时采用非参数检验,两变量间采用pearson相关性分析。P0.05认为具有统计学意义。结果:1.利用流式细胞仪检测P3代hUCMSCs。结果表明,CD105、CD90、CD73均表达阳性,表达率分别为99.3%、96.3%、96.7%;CD34、CD45、CD14和HLA-DR均表达阴性,表达率分别为0.1%、0.1%、0.3%和0.1%。2.0w时,五组小鼠体重水平相当(P0.05)。8w时,NOD-T_1DM组小鼠体重发病时明显减轻,INS组、Res组、hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组小鼠体重与NOD-T_1DM组相比明显增加(P0.05),但与发病初期相比无明显变化。3.0w时,五组小鼠血糖水平相当(P0.05)。在第8w末,INS组、Res组、hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组这四个干预组血糖水平与0w时相比均出现下降,但Res组下降幅度较小,血糖仍维持在较高水平,NOD-T_1DM组小鼠血糖与0w时相比数值更高(P0.05)。4.血尿素氮、肌酐、24hUAER:NOD-T_1DM组小鼠血尿素氮、肌酐、24hUAER水平较高,给予白藜芦醇、干细胞、胰岛素治疗后均出现明显下降。其中,hUCMSCs+Res组24hUAER降低幅度最大。Res组血尿素氮、肌酐、24hUAER水平与INS组相比差别无统计学意义(P0.05),而hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组与INS组相比明显下降(P0.05)。5.光镜下病理切片观察:PAS染色可见,NOD-T_1DM组肾小球系膜及细胞外基质严重增生,肾小球肥大,肾小囊呈裂隙状,肾小管壁不规则增厚,内皮细胞肿胀,管腔狭窄,部分可见空泡变性、萎缩或扩张。INS组、Res组、hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组均较NOD-T_1DM组病变轻微。其中,hUCMSCs+Res组肾损害最轻。6.足细胞计数:NOD-T_1DM组足细胞计数较少,INS组、Res组、hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组足细胞计数均较NOD-T_1DM组明显增加,其中,hUCMSCs+Res组增加最明显。与INS组相比,Res组足细胞计数差别无统计学意义(P0.05),而hUCMSCs组和hUCMSCs+Res组明显增加(P0.05)。7.电镜下观察:8周末,NOD-T_1DM组肾小球毛细血管基底膜不规则性增厚,模糊不清,有较多足突融合,甚至足突消失。各治疗组也可见足突融合,但较NOD-T_1DM组明显改善(P0.05),且hUCMSCs+Res组明显优于hUCMSCs组及Res组、INS组。8.Western blot定量检测MCP-1、RAGE、Nephrin和WT1蛋白表达的变化:NOD-T_1DM组MCP-1和RAGE蛋白表达水平较高,各治疗组与NOD-T_1DM组相比均有降低(P0.05)。其中,hUCMSCs+Res组两种蛋白表达水平均为最低。Nephrin和WT1蛋白表达在NOD-T_1DM组表达水平较低,各治疗组与NOD-T_1DM组相比均有明显增加(P0.05)。其中,hUCMSCs+Res组两种蛋白表达水平均为最高。9.免疫组化染色:NOD-T_1DM组MCP-1、RAGE蛋白阳性染色范围及染色深度明显增强,为强阳性。各治疗组MCP-1、RAGE表达均不同程度减少,hUCMSCs+Res组较NOD-T_1DM组减少最明显。NOD-T_1DM组小鼠肾小球nephrin、WT1阳性染色范围较小,且呈颗粒状不均匀分布,各治疗组nephrin、WT1染色均不同程度增加。hUCMSCs+Res组较NOD-T_1DM组增加最明显。半定量分析结果示MCP-1、RAGE、nephrin、WT1蛋白表达与western blot有相同趋势。10.相关分析:24hUAER与MCP-1、RAGE蛋白表达(western blot)之间呈显著的正相关关系(r=0.874,r=0.819,respectively,p0.001),24hUAER与足细胞计数、nephrin蛋白表达、WT1蛋白表达(western blot)之间均呈显著的负相关关系(r=-0.885,r=-0.935,r=-0.928,p0.001)。结论:hUCMSCs对糖尿病小鼠具有降低血糖、减少尿蛋白、增加足细胞数目、减少MCP-1、RAGE表达并增加足细胞相关蛋白nephrin、WT1表达的作用。白藜芦醇同样可以减少尿蛋白、保护肾脏足细胞功能,且这种作用不依赖于血糖的水平,二者联合治疗可以更好的保护肾脏足细胞功能,不论在降低血糖还是减轻肾损伤方面都优于胰岛素治疗。我们推测脐带间充质干细胞联合白藜芦醇可以抑制NF-κB的启动,减少炎症因子MCP-1的分泌,从而上调了足细胞相关分子的表达,减轻了足细胞的炎症损伤。