海生红藻多管藻中四种R-藻红蛋白的分离、纯化及多肽组成分析

【摘要】：本研究用50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0)浸泡一种海生红藻多管藻(Polysiphonia urceolata Grev),经过超声波破碎和硫酸铵沉淀,得到藻胆蛋白粗提液。经过DEAE-52离子交换层析分离藻胆蛋白粗提液,得到有电荷差异的四种藻红蛋白(phycoerythrin, PE)和一种藻蓝蛋白(phycocyanin, PC),其中藻红蛋白为主要研究对象。然后经过Sephadex G-150和Sephacryl S-300凝胶过滤层析对这四种藻红蛋白进行纯化,分别为PE_(169)-1、PE_(267)-1、PE_(356)-2和PE_(523)-2。这四者具有非常相似的吸收光谱和荧光光谱,分别在498 nm、540 nm和565 nm左右处都有特征吸收峰,在576 nm处有一个荧光发射峰;四种藻红蛋白中除PE_(169)-1外,其它三种藻红蛋白PE_(267)-1、PE_(356)-2和PE_(523)-2在非变性的PAGE和非变性的IEF中均表现为单一条带,且等电点分别为4.5、4.4和4.4。PE_(169)-1含量较少,非变性的PAGE和IEF、变性的IEF和SDS-PAGE分析表明其可能为藻红蛋白六聚体解离的小分子PE。 PE_(267)-1、PE_(356)-2和PE_(523)-2的SDS-PAGE、变性等电聚焦和二维电泳结果表明:三者均由三种相同的含发色团的有色亚基组成,其分子质量分别为18.4 kDa (α)、20.7 kDa (β)和34.5 kDa (γ),其比例为3α:3β:1γ,且PE_(356)-2和PE_(523)-2还含有45.7 kDa的无发色团多肽(Lnk45.7),PE_(523)-2含有62.1 kDa的无发色团多肽(Lnk~(62.1)),其比例分别为6α:6β:2γ:1Lnk45.7 , 6α:6β:2γ:0.5Lnk~(62.1) ,可能的存在形式为(αβ)3-γ-(αβ)3-γ、γ-(αβ)3-γ-(αβ)3- Lnk45.7和γ- (αβ)3-γ-(αβ)3- Lnk~(62.1)。和γ亚基一样,Lnk45.7和Lnk~(62.1)可能作为连接多肽在“杆”结构域连接六聚体R-PE。二维电泳分析表明,α亚基有等电点不同的三种形式,其等电点分别为5.95、5.80和5.65;β亚基五种不同形式,等电点分别为5.56、5.46、5.33、5.25和5.11。这些结果为R-PE六聚体及其构建大型红藻藻胆体“杆”结构域研究提供了有价值的实验资料。本实验建立的层析、PGAE、IFE和二维电泳的方法可应用于其它大型红藻的藻胆蛋白组成研究。