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Hes1 decoy ODN通过干预Hes1与miR-23b/27b/24-1之间的调节环抑制肝星状细胞活化的研究

袁文芳  
【摘要】:目的:本研究旨在运用分子生物学技术明确转录因子Hes1与基因簇miR-23b/27b/24-1之间是否存在负反馈式的调节环;探究适配体AC4WJF能否将Hes1decoy ODN递送至大鼠肝星状细胞(HSC-T6)和TGF-β1刺激活化的原代大鼠肝星状细胞(HSCs);探索Hes1 decoy ODN竞争性捕获Hes1后,能否有效的调控肝纤维化相关基因的表达,验证Hes1 decoy ODN对活化的肝星状细胞的抑制作用。方法:(1)通过生物信息学软件Targetscan预测大鼠Hes1的3′非编码(3′UTR)区上miR-23b/27b/24-1各成员的结合位点;并用JARSPAR软件预测大鼠miR-23b/27b/24-1启动子上Hes1的结合位点。(2)克隆不同长度的大鼠miR-23b/27b/24-1的启动子片段,分别构建4个荧光素酶报告质粒p GLuc-P1/P2/P3/P6-miR-23b cluster;通过荧光素酶报告基因分析法,验证转录因子Hes1对基因簇miR-23b/27b/24-1启动子的作用。(3)克隆大鼠Hes1-3′UTR的DNA片段,构建荧光素酶报告质粒p MIR-Luc-Hes1-3′UTR;运用重叠延伸PCR技术,突变Hes1-3′UTR上的miR-23b和miR-27b的结合位点,构建突变型荧光素酶报告质粒p MIR-Luc-Hes1-3′UTR-mutant23b/27b;人工合成miR-23b、miR-27b的类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor);通过荧光素酶报告基因分析法,验证miR-23b、miR-27b对Hes1-3′UTR的作用;构建大鼠miR-23b/27b/24-1真核表达质粒p CDH-miR-23b/27b/24-1;western blot检测miR-23b/27b/24-1对HSC-T6细胞中Hes1表达的影响。(4)通过Confocal Microscope观察,探究适配体AC4WJF能否将Hes1 decoy ODN递送到HSC-T6细胞和TGF-β1刺激活化的原代HSCs细胞中。(5)Western blot检测Hes1 decoy ODN对HSC-T6细胞,TGF-β1刺激活化的HSC-T6细胞和原代HSCs细胞中肝纤维化相关基因表达的影响。(6)RT-PCR检测Hes1 decoy ODN对HSC-T6细胞中miR-27b表达的影响。结果:(1)成功构建了荧光素酶报告质粒p GLuc-P1/P2/P3/P6-miR-23b cluster和真核表达质粒p CDH-Hes1,证实了转录因子Hes1能下调基因簇miR-23b/27b/24-1启动子的活性。(2)成功构建了荧光素酶报告质粒p MIR-Luc-Hes1-3′UTR及p MIR-Luc-Hes1-3′UTR-mutant23b/27b,证实了miR-23b和miR-27b能靶向沉默Hes1;成功构建了大鼠真核表达质粒p CDH-miR-23b/27b/24-1,证实了miR-23b/27b/24-1能下调Hes1的表达。(3)适配体AC4WJF能将Hes1 decoy ODN递送到HSC-T6细胞和TGF-β1刺激活化后的原代HSCs细胞中,且定位于细胞核。(4)Hes1 decoy ODN能有效下调HSC-T6细胞中Hes1、Smad 2/3、TGF-β2、COLIα1、COLIα2、ITGα5、TIMP1的表达,有效上调HSC-T6细胞中MMP2和MMP9的表达;有效下调TGF-β1刺激活化的HSC-T6细胞中COLIα1、COLIα2、ITGα5的表达。(5)Hes1 decoy ODN能有效下调TGF-β1刺激活化的原代HSCs细胞中COLIα1和ITGα5的表达。(6)Hes1 decoy ODN能启动HSC-T6细胞中miR-27b的内源性表达。结论:(1)转录因子Hes1能下调基因簇miR-23b/27b/24-1启动子的活性;miR-23b/27b/24-1能直接靶向沉默Hes1;转录因子Hes1与基因簇miR-23b/27b/24-1之间存在负反馈式的调节环。(2)运用适配体AC4WJF将Hes1 decoy ODN递送到活化肝星状细胞的细胞核后,Hes1 decoy ODN通过阻断转录因子Hes1与基因簇miR-23b/27b/24-1之间负反馈式的调节环,启动miR-27b的内源性表达,进而抑制肝星状细胞活化。


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