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南林895杨转小鼠金属硫蛋白(MT)基因研究

柴文娴  
【摘要】:重金属污染是影响环境质量和生态稳定的主要问题之一,它不仅影响大气和水环境的质量、农作物的生长,而且通过食物链严重危害动物和人类的健康。由于重金属污染的广泛性及其自身不可降解的特点,治理起来十分困难。哺乳动物金属硫蛋白(Metallotheinoin,MT)是动物体内能专性与重金属结合的一类低分子量、高巯基含量的蛋白质,本研究以MT基因为目的基因,选择生物量大、生长迅速的植物(南林895杨)为基因转移的靶植物,利用植物基因工程技术将目的基因整合到靶植物基因组中,获得转MT基因杨树,用于富集污染土壤中的有害重金属,从而达到修复生态,从源头上控制和减少重金属进入食物链,更大范围内防治动物和人类重金属中毒发生的目的。 实验首先构建了带有小鼠金属硫蛋白(MT)基因的植物表达载体pCAMBIA2301-MT,以南林895杨组织培养苗为受体植物,通过农杆菌介导的方法,展开了小鼠金属硫蛋白基因(MT)的植物遗传转化的前期研究,为最终获得目的基因稳定遗传和高效表达的转基因杨树,利用MT结合重金属的特性富集污染土壤中的重金属提供基础。 1、植物表达载体pCAMBIA2301-MT的构建 利用DNA重组技术将包含35S-35S启动子、AMV、Tnos的MT基因表达框定向克隆至植物中间表达载体pCAMBIA2301中,该载体使用卡那霉素筛选基因,并增加了gus报告基因,新构建的载体可通过根癌农杆菌EHA105导入杨树基因组,酶切和PCR鉴定表明质粒成功构建。 2、农杆菌转染后杨树叶盘脱菌用抗生素种类和浓度的确定 使用四种抗生素(羧苄青霉素(Carbenicillin, Cb)、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)、头孢霉素(Cefotaxime, Cef)、替卡西林克拉维酸钾(Timentin, Tim))进行外植体脱菌的抗生素筛选实验,确定使用浓度为200mg/L的头孢霉素(Cefotaxime, Cef)时,既不会影响南林895杨叶盘的分化效率,又能够有效抑制农杆菌的生长。 3、真空渗透法转染农杆菌条件的确定 根据农杆菌转染叶盘后GUS染色的结果,确定在杨树叶盘预培养3d,菌液浓度OD6000.5,真空抽吸5min,共培养2d的转化体系下,杨树的转化率最高。经PCR检测,获得2株阳性苗。 4、gus报告基因的表达 植物表达载体pCAMBIA2301-MT在农杆菌的介导下转染南林895杨后,其上带有的gus报告基因成功表达,经X-Gluc染色、70%乙醇脱色后可观察到蓝色的Gus表达位点。


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