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黄瓜(Cucumis sativus L.)遗传转化、植株再生及驯化技术研究

徐冉  
【摘要】:黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界范围内的重要蔬菜。一方面,建立一套稳定的遗传转化体系可为运用过量表达、报告基因表达和RNAi等技术进行黄瓜功能基因组学研究提供技术支撑;另一方面,由于黄瓜现有栽培品种的遗传基础十分狭窄,与黄瓜属其他野生资源远缘杂交的亲合性很低,采用传统育种方法很难在短时间内获得对生物或非生物胁迫具有抗性的优良品种,而植物基因工程是扩大黄瓜现有资源遗传基础的有效途径。为此,本试验建立了稳定的黄瓜瞬时表达和成株遗传转化体系,主要结果如下: 1构建了由CaMV35S启动子调控的、2种黄瓜a-半乳糖苷酶的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flurescent protein, EGFP)融合表达载体。运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,以质粒pCambia1303为模板扩增了CaMV35S启动子序列;以质粒pEGFP-N1为模板扩增了EGFP编码序列;运用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcript-PCR, RT-PCR)技术,以黄瓜总RNA为模板扩增了黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ或碱性α-半乳糖苷酶Ⅰ编码序列。将上述3个片段插入表达载体pCambia1381*c的多克隆位点,分别构建了EGFP位于目的基因C端的2个α-半乳糖苷酶基因的EGFP融合表达载体。 2在NH4NO3浓度为2.0g/L、6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.1mg/L的MS培养基中添加酵母提取物5g/L有利于产生质地疏松的愈伤组织,适合作为外源基因瞬时表达的受体。基因枪法将上述经测序验证的2个表达载体分别导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况。结果表明黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ在包括液泡在内的整个细胞中均有表达,而黄瓜碱性α-半乳糖苷酶Ⅰ主要在细胞核和细胞周边表达。 3通过比较两种野生型黄瓜品种的不同外植体,发现欧洲型黄瓜EP-6适合用子叶为外植体诱导再生植株,华北型黄瓜津春4号适合用茎节作为外植体诱导再生植株。适合EP-6子叶再生芽的最佳芽诱导培养基为(MS±0.5mg/L ABA+2.0mg/L6-BA+2.0mg/L AgNO3);适合津春4号茎节再生芽的最佳诱导培养基为(MS±0.5mg/L6-BA);最佳生根培养基为(1/2MS+15g/L蔗糖+0.6mg/L IBA)。 4EP-6子叶转化体系的建立:将子叶在上述最佳诱芽培养基上预培养2d,以菌液pCambia2201/EHA105侵染20min,在含50μmol/LAS的最佳芽诱导培养基中黑暗条件下共培养2d,转入选择培养基(最佳诱芽培养基+400mg/L Cef)中筛选抗性芽,光照条件下培养25d左右,有抗性芽长出时转入伸长培养基中培养。抗性芽2cm左右时转入生根培养基,获得抗性株系,伸长培养和生根培养时添加60mg/L Kan和400mg/L Cef进行筛选。 5津春4号的茎节转化体系的建立:将茎节在最佳诱芽培养基上预培养2d,以菌液pCambia2201/EHA105侵染20min,在含50μmol/LAS的最佳芽诱导培养基中黑暗条件下共培养2d,转入选择培养基(最佳诱芽培养基+400mg/L Cef)中筛选抗性芽,光照条件下培养,12d左右有抗性芽长出时转入伸长培养基中培养。抗性芽2cm左右时转入生根培养,获得抗性株系,伸长培养和生根培养时添加80mg/L Kan和400mg/L Cef进行筛选。 6统计结果显示,以津春4号的黄瓜茎节为外植体时,从共培养开始到转化苗生根平均需42d;以EP-6黄瓜的子叶作为外植体时,从共培养开始到转化苗生根平均需59d。若以RT-PCR阳性作为判断最终转化成功的标准,津春4号茎节转化体系的转化率为0.83%,EP-6子叶转化体系的转化率为0.36% 7将转基因组培苗于蔗糖浓度为6%的1/2MS培养基中生根4周,随后移栽至蔗糖为3%的培养基中培养1周,在组培苗6叶1心时,移栽于草碳:珍珠岩:河沙=1:1:1的基质中驯化,最有利于组培苗根系的发育,驯化成活率可达98.7%。


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