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表达鸡新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的临床前研究

甘军纪  
【摘要】:鸡新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的家禽最严重的传染病之一。NDV的病毒囊膜含有2个主要的糖蛋白,即融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN),它们都被用于重组鸡痘病毒疫苗的研究。本研究从我们实验室已构建的单表达、共表达新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因的重组鸡痘病毒中筛选一个作为疫苗候选株,进一步完善实验室试验,并在GMP条件下完成中间试制,为新城疫重组鸡痘病毒活疫苗顺利进入临床试验打好了基础。 1.单表达和共表达NDV F和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验 为评价母源抗体对抗新城疫(ND)重组鸡痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影响,本研究用单表达、共表达NDV基因Ⅶ型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12LSF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳剂灭活疫苗分别免疫14日龄商品蛋鸡,重组鸡痘病毒疫苗的免疫剂量均为2×104PFU,免疫后21d分别用106ELD50NDV不同强毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保护率分别为30.3%、73.2%、41.1%、89.3%;而ZJ1株攻毒的免疫保护率分别为35.8%、67.9%、78.6%、100%。用表达鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒rFPV-12LSIL-2与rFPV-12LSHN联合免疫没有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保护力。试验结果表明,单表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒rFPV-12LSHN可作为ND活疫苗候选株,为ND重组鸡痘病毒活疫苗的进一步应用性开发奠定了基础。 2.表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究 为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察重组鸡痘病毒(rFPV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),结果表明在FPV中插入NDV血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因(rFPV-12LSHN)后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程。rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无显著差异。rFPV-12LSHN接种11日龄鸡胚,在尿囊膜(CAM)上观察到典型痘斑或水肿,鸡胚最小感染量≤100PFU。免疫荧光试验证明,rFPV-12LSHN在CEF上传代能稳定表达NDV HN抗原。rFPV (103PFU/羽)接种SPF鸡快速诱导NDV HI抗体应答,免疫3周后完全保护NDV强毒攻击。 3.表达新城疫HN基因的重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究 为了评价表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒(FPV)疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平(P0.01),对NDV强毒攻击的保护率没有影响。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN勺二次免疫可以提高疫苗的免疫力。 4.重组鸡痘病毒活疫苗X-gal染色空斑计数法的建立 建立了一种简易的携带LacZ基因重组鸡痘病毒(rFPV)活疫苗的X-gal染色空斑计数法。rFPV接种次代鸡胚成纤维细胞(CEF)72h后,加2mL/L戊二醛固定液室温固定15min,再加500ug/mL X-gal染色液37℃过夜,倒置显微镜下直接计数蓝染空斑。染色空斑计数法的空斑数是不染色直接计数法的1.6-3.3倍。该方法在重组鸡痘病毒活疫苗研究及其工业化生产检验中具有较大的应用价值。 5.鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的中试生产 为了给临床试验提供疫苗,在GMP条件下进行了鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗(rFPV-ND-HN)的中试生产。CEF作为制苗材料,培养于10000ml转瓶,按0.2PFU/细胞接种毒种rFPV-12LSHN,37℃12转/h旋转培养,待细胞病变达到80%,收获感染细胞,加适量的5%蔗糖-脱脂奶粉,随后冻干。共生产了5批rFPV-ND-HN冻干疫苗,质量指标全部达到标准要求。 总结 1.筛选出单表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)作为疫苗候选株。 2. rFPV-12LSHN与亲本毒株FPV-LP在CEF细胞内的病毒形态、繁殖方式以及病毒产量没有明显变化。 3. rFPV-12LSHN活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周。 4. rFPV-12LSHN勺二次免疫可以显著提高疫苗的NDV HI抗体应答。 5.建立了一种简易、快速、敏感的重组鸡痘病毒活疫苗的X-gal染色空斑计数方法。 6.在GMP条件下中试生产了5批rFPV-ND-HN疫苗。


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