收藏本站
收藏 | 论文排版

大肠杆菌Ⅰ型群体感应功能研究

羊扬  
【摘要】:病原性大肠杆菌是感染人类和动物的重要病原菌,严重危害畜牧养殖业并造成巨大的经济损失。大肠杆菌致病性与其自身毒力因子密切直接相关,而这些毒力因子必需共同作用于宿主机体,发挥毒力致病作用,造成机体损害。值得注意的是,毒力因子在体内受到严格调控,而群体感应系统则参与了这一重要调控过程。本试验研究探析了大肠杆菌群体感应I型系统的相关调控功能,为病原体和机体相互作用的准确机制深入研究和大肠杆菌感染的防控提供新颖的理论基础。 在细菌生长过程中,能够释放特定信号分子;通过对这些信号分子的感知,细菌可以确定周边环境中的同类数量,并据此调节特定信号分子相关的多种毒力基因:这种现象被称作群体感应(Quorum Sensing),而参与群体感应系统的特定信号分子被称为自体诱导子(Autoinducer,AI),主要包括AI-1和AI-2两类分子。在II型群体感应系统中,luxS和pfs两基因在AI-2合成中起着重要作用,是已知重要相关基因;而在I型群体感应系统中,由于大肠杆菌自身缺乏合成酰基高丝氨酸内酯(AHL)的合成酶luxI,而仅具有AI-1受体,即LuxR同源蛋白SdiAo大肠杆菌AHL受体SdiA蛋白为非水溶性包涵体,只有在感知外源AHL信号分子后,此时AHL受体SdiA蛋白才能被激活,有相当一部分转化为有效折叠的可溶性功能蛋白,并发挥调控作用。研究人员尝试用过表达SdiA受体蛋白、添加外源AHL信号分子、构建重组大肠杆菌合成内源性AHL的方法,对大肠杆菌I型群体感应系统及其介导的细菌相关生理现象进行了一定程度的前提研究,包括激活细胞分化基因簇ftsQAZ,提高对丝裂霉素C、喹诺酮类及其他种类抗生素的抗性;细菌运动性受到抑制;QS-II活力受到抑制;然而,由于一直无法从动物消化道内获取合成AHL并为大肠杆菌提供AI-I的菌株源,阻碍了病原性大肠杆菌I型群体感应系统功能的深入探讨,并引发肠道环境中是否存在激活大肠杆菌I型群体感应系统的外源AHL的质疑。事实上,之前研究人员通过多种手段进行筛选,均没有成功先例。在牛瘤胃中,虽然分泌合成这些特定AHL信号分子的特定细菌同样一直没有成功分离,然而多种QS-I型系统信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL)却在牛瘤胃中存在,成功分离,并对其功能进行检测;这些AHL信号分子被认为在牛消化道内参与调节食源性病原菌基因表达和调控,在病原菌通过胃肠消化道及消化道内生存定殖进程中发挥重要作用。其中,AHL信号对病原大肠杆菌0157:H7致病过程的调节尤为引起研究人员关注,显得尤为重要。鉴于上述研究积累和AHL阳性菌必然存在的理论推测,我们在牛瘤胃菌平台上进行研究,设计出一种改进的AHL阳性菌分离方案,在牛瘤胃和猪肠道内成功筛选出AHL阳性菌,并就AHL产生的特征、功能和病原大肠杆菌互作进行了深入探析。富集、蒸发和浓缩等重要步骤增加在改进的筛选流程中,由牛瘤胃液中成功分离了一株铜绿假单胞菌,命名为YZ1,并对其合成AHL的能力进行鉴定。基于JZA1报告菌中含有lacZ报告基因,在AHL存在环境中能够激活半乳糖苷酶活性的特性,其探测范围和对AI-1敏感度较高,我们选定该报告菌定量检测YZ1产AHL能力,发现在6h时合成能力达到最高峰;16s rDNA法被运用于对YZ1菌的鉴定,确认其为铜绿假单胞菌;考虑到仅利用JZA1检测而可能产生的假阳性结果,利用CV026报告菌在感知到外源AHL的环境中激活紫色色素合成的特性,进一步确认其AHL合成能力;随后利用pSB401、pSB1142两株报告菌分别用于感知短链、长链AHL并对YZ1合成AHL的种类进行检验;利用液质联谱,在YZ1培养上清中鉴定出至少三种不同的AHL分子,包括C4-HSL、C8-HSL、3-oxo-C12-HSL。将铜绿假单胞菌YZ1株中短链和长链AHL的合成基因lasI及rhlI分别克隆入0157:H7大肠杆菌,成功赋予其自身合成AHL的能力,并进一步证明铜绿假单胞菌合成的AHL能调控大肠杆菌相应基因表达,激活SdiA受体蛋白表达上调约1.7倍;泳动实验和耐酸性实验表明,铜绿假单胞菌合成的AHL调控大肠杆菌的生理代谢,受调控重组大肠杆菌运动性下降25%,耐酸性提高约4倍,且上述表型变化与鞭毛FliC编码基因的4倍下调、gad耐酸性基因的2倍上调相符一致。综上研究结果表明,宿主体内特定群细菌通过I型群体感应系统参与对大肠杆菌相关基因和毒力的调控。这是首次成功由牛瘤胃中分离出AHL阳性菌,并对其AHL合成能力和特性进行鉴定,进而为肠道细菌通过群体感应系统与大肠杆菌体内互作提供了新颖证据,第一次实验验证了牛瘤胃大肠杆菌群体感应I型系统假说模型。 鉴于研究人员一直未能成功在猪肠道内分离出AHL阳性菌,阻碍了对猪源大肠杆菌QS-I型系统功能的深入研究。为了继续挖掘群体感应I型系统对猪源大肠杆菌毒力的调控机制,基于成功改良的筛选方法和手段,由猪肠道内容物中首次分离出AHL阳性菌,命名为嗜水气假单胞菌YZ2,并对其合成AHL的能力进行鉴定。利用JZA1报告菌对AHL信号的高度敏感性定量检测YZ2产AHL能力;16s rDNA法被运用于对YZ2的鉴定,确认其为嗜水气假单胞菌:同样考虑到仅利用JZA1检测可产生假阳性结果,同时利用CV026报告菌进一步确认其AHL合成能力;进而利用pSB401、pSB1142两株生物报告菌分别用于感知短链、长链AHL并对YZ2合成AHL的种类进行检验,发现其只能合成短链AHL;利用液质联谱,在YZ2培养上清中鉴定出C4-HSL优势AHL分子。将YZ2中luxI同源基因、AHL合成酶基因ahyl分别克隆入猪源F18ab大肠杆菌中,成功赋予大肠杆菌合成内源性AHL的能力,并进一步证明大肠杆菌能够运用嗜水气假单胞菌合成的外源AHL能够激活SdiA受体蛋白,上调其表达约1.8倍;同时通过泳动实验和耐酸性实验,证明其能够通过AHL调控大肠杆菌的生理代谢,受调控重组大肠杆菌运动性下降25%,耐酸性提高约3倍;此表型变化与鞭毛FliC编码基因的5倍下调、gad耐酸性基因的4倍上调相符-致;综上研究结果证明猪肠道内特定细菌群可以通过群体感应系统调控猪源大肠杆菌毒力,也为深入猪源大肠杆菌与肠道内细菌互作提供了新颖证据和研究平台。 在确定牛瘤胃、猪肠道内存在AHL阳性菌,能够产生释放AHL调节大肠杆菌毒力,并且对牛源、猪源大肠杆菌均起到抑制鞭毛表达作用的基础上,为了进一步验证大肠杆菌毒力受QS-I系统的调控机制,本研究选择了猪源F18大肠杆菌作为研究对象,同时将小肠结肠炎耶尔森菌luxI同源基因yenI克隆入F18大肠杆菌107/86。表达基因yenI重组菌能够合成内源性高丝氨酸内酯AHL,并通过生物报告菌CV026介导cross-streaking试验检测加以验证。在合成内源AHL的重组菌中,利用泳动平板实验,发现鞭毛表达受到抑制,运动性减弱约33%;利用结晶紫法对生物被膜进行定量检测,发现生物被膜形成能力减弱约32%;利用生物报告菌BB170对生物发光现象进行检测,发现群体感应Ⅱ型系统活性同样受到抑制,在对数期下调30%。通过粘附实验检测细菌对猪小肠上皮细胞的黏附能力,重组菌中下降至野生株的25%;通过庆大霉素杀灭细胞周围未侵袭的大肠杆菌以进行侵袭实验,证明重组菌对IPEC-J2的侵袭能力同样受到削弱,降至野生株的30%,利用荧光定量PCR对鞭毛受抑制的现象加以确认。本研究为进一步确认A1-I在调控大肠杆菌毒力中的关键作用进行了探讨。 在之前的研究中,我们发现大肠杆菌Ⅰ型、Ⅱ型群体感应系统同时参与了大肠杆菌鞭毛调控进程。为进一步阐明其调控机制,我们选择F18大肠杆菌107/86作为研究对象,构建了表达内源性AHL的重组菌与Ⅱ型luxS基因缺失株,从而建立起研究Ⅰ型群体感应系统和Ⅱ型系统的平台,并在此基础上检验其对鞭毛调控的影响。泳动实验、荧光定量、及免疫因子定量实验均被用于对鞭毛表达量的检测。鞭毛素本身的缺失同样能对群体感应Ⅱ型系统活性产生抑制作用,故而证明群体感应系统与鞭毛素表达之间存在着相互协同调控机制。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 钟增涛,郑会明,高轶静,王卉,崔中利,李顺鹏,朱军;细菌中的群体感应[J];生命的化学;2003年06期
2 周玥,刘小锦,朱晨光,孙明,喻子牛;细菌中群体感应调节系统[J];微生物学报;2004年01期
3 陈峰;微生物的群体感应信号分子(综述)[J];上海农业学报;2005年01期
4 温晓芳,黄俊生;细菌的群体感应及其信号分子[J];华南热带农业大学学报;2005年01期
5 郑会明,钟增涛,陈一楠,朱军;根瘤菌与群体感应[J];生态学杂志;2005年05期
6 李承光;贾振华;邱健;张霞;马宏;冀营光;宋水山;;细菌群体感应系统研究进展及其应用[J];生物技术通报;2006年01期
7 李俊英;王荣昌;夏四清;;群体感应现象及其在生物膜法水处理中的应用[J];应用与环境生物学报;2008年01期
8 江启沛;;细菌群体感应效应及其应用研究进展[J];河北农业科学;2009年11期
9 刘佳;郭继强;李宪臻;;群体感应与群体淬灭及其在抗微生物感染中的潜在应用[J];生物技术通讯;2010年03期
10 马月;陈晓艺;李宪臻;;微生物群体感应及其在感染性疾病治疗新策略中的潜在应用[J];安徽农业科学;2010年18期
11 罗利龙;娄瑞娟;邱健;宋水山;;细菌群体感应及其干扰策略的研究进展[J];生物学杂志;2010年06期
12 储卫华;刘永旺;朱卫;;群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立[J];生物技术通报;2011年03期
13 姜巨全;肖鸿禹;胡宝忠;;细菌群体感应分子水平调控机制研究进展[J];黑龙江大学自然科学学报;2013年02期
14 许玉彬;张颖;王淼;王少伟;王刚;;细菌群体感应研究进展[J];河南农业科学;2013年12期
15 王楠;魏云林;唐兵;张琦;林连兵;季秀玲;;群体感应及其介导的抗噬菌体研究进展[J];中国微生态学杂志;2014年01期
16 戴昕;周佳恒;朱亮;徐向阳;;生物聚集体中群体感应作用的研究进展[J];应用生态学报;2014年04期
17 张彩丽;朱素琴;汪映;孙秀娇;曾名湧;;一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象[J];生物技术通报;2014年07期
18 韦珂;;细菌群体感应的研究进展[J];广西农业生物科学;2007年S1期
19 陈艳;李红梅;李淑英;;微生物细胞交流的方式——群体感应[J];畜牧与饲料科学;2009年05期
20 华楠;黄炎;胡满峰;;具有延迟群体感应的浮游植物系统解的存在性、唯一性和稳定性分析[J];江南大学学报(自然科学版);2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 许岩;宋运忠;;基于改进基因群体感应耦合模型的基因系综时钟同步[A];中国自动化学会控制理论专业委员会C卷[C];2011年
2 宋水山;;含群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
3 胡杨波;王瑶;;群体感应调控对细菌生物膜形成的影响[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
4 田静;张玉倩;翁丽星;汪联辉;;新的群体感应信号分子-DSF[A];中国化学会第七届有机化学学术会议图文摘要集[C];2011年
5 陈涛;钱国良;胡白石;刘凤权;;瓜类细菌性果斑病菌群体感应调节系统的鉴定与功能研究[A];第四届中国植物细菌病害学术研讨会论文集[C];2008年
6 宋增福;范斌;郭婧;李娟英;潘连德;张庆华;;具有群体感应(Quorum sensing)抑制效果芽孢杆菌的筛选与鉴定[A];中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编[C];2013年
7 胡杨波;王瑶;张勇;戴岳;杨宝玉;陈士云;;QS信号分子调控对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
8 刘鹏;赵廷昌;;哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应系统相关基因的克隆[A];第四届中国植物细菌病害学术研讨会论文集[C];2008年
9 陈小兰;周丽娟;王波;陈善娜;;AHLs类信号分子对滇池铜绿微囊藻生长的影响[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年
10 王朋;孔垂华;;微生物群体感应信号物质及其在植物-微生物相互关系中的作用[A];中国第四届植物化感作用学术研讨会论文摘要集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 史晓翀;海洋微生物中细菌群体感应抑制因子的筛选与作用机制研究[D];中国海洋大学;2008年
2 张建宝;振子网络上的同步及其在生物学中的应用[D];上海大学;2008年
3 羊扬;大肠杆菌Ⅰ型群体感应功能研究[D];扬州大学;2014年
4 李斌;黑木耳黑色素对细菌群体感应调控行为的抑制及其抗氧化活性的研究[D];南京农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王为善;以细菌群体感应为靶标的抑制因子筛选[D];中国海洋大学;2009年
2 邱健;含细菌群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定[D];河北工业大学;2006年
3 武双;真菌群体感应分子调控产油酵母的研究[D];东北大学;2008年
4 曹倩;基于群体感应的复杂网络的同步问题研究[D];江南大学;2012年
5 郑昕;群体感应理论在Pseudomonas sp.HF-1定植中的作用及其应用潜能分析[D];浙江工商大学;2014年
6 周丽曼;革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的筛选与活性评价[D];中国海洋大学;2013年
7 陈永明;基于中草药的群体感应抑制因子的筛选[D];福建农林大学;2012年
8 孙琦;细菌群体感应抑制剂的设计、合成及活性评价[D];吉林大学;2014年
9 汪映;副溶血弧菌群体感应与调控的初步研究[D];中国海洋大学;2014年
10 尹守亮;群体感应抑制活性海洋微生物的筛选与抑制因子活性评价[D];中国海洋大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978