α-硫辛酸在小鼠卵母细胞老化过程中的作用

【摘要】：哺乳动物的繁殖能力受多种因素的影响,动物个体本身的衰老和生殖细胞的老化严重影响动物的繁殖效率,而其中卵母细胞的老化严重降低了雌性动物的繁殖能力。受各种原因的影响,卵母细胞会发生不同程度的老化,这不仅造成体内外受精率降低,胚胎质量低下,早期妊娠流产可能性增加,后代发育异常等问题,而且限制了体外受精(IVF)、体细胞核移植(SCNT)及胞浆内单精子注射(ICSI)等技术的快速发展及广泛应用。因此研究卵母细胞老化及调控机制显得尤为重要。α-硫辛酸(a-lipoic acid)是种存在于线粒体内的生物抗氧化剂,几乎对所有自由基均有清除作用。本研究以小鼠卵母细胞为材料,在研究卵母细胞老化进程的基础上,通过体外添加α-硫辛酸(LA),采用体外受精、孤雌激活、免疫荧光等技术,研究其在卵母细胞体外老化过程中的作用,同时探讨α-硫辛酸和自噬在抗老化过程中的作用和联系。1、α-硫辛酸延缓卵母细胞的体外老化进程在卵母细胞的体外老化过程中,体外受精率显著下降,由老化前的87.71%±6.35%下降至67.55%±6.44%,同时受精后的细胞异常率升高,由老化前的2.05%土2.12%升高至12.85%±4.20%,细胞极性丢失(肌动蛋白帽丢失),纺锤体形态发生异常,组蛋白H4K8和H4K12乙酰化水平升高。在卵母细胞体外老化过程中添加10μmol/L的α-硫辛酸后,与未添加组(正常老化)相比,卵母细胞的体外受精率升高至83.19%±8.00%；受精后的异常率下降至4.46%±2.07%,纺锤体形态趋于正常,细胞极性尚存,组蛋白H4K8和H4K12乙酰化水平较低。结果表明α-硫辛酸可以延缓卵母细胞的体外老化进程。2、α-硫辛酸抑制体外老化卵母细胞中自噬水平的升高首先,检测了卵母细胞体外老化过程中的自噬水平。结果表明,在卵母细胞体外老化10h内,自噬水平呈逐渐升高的趋势。其次,添加自噬增强剂(Rapa)或自噬抑制剂(3-MA)来为干扰自噬水平后,检测卵母细胞老化进程。结果显示,与未处理组相比添加Rapa后,卵母细胞的体外受精率极显著降低(p0.01),受精后的异常率显著升高(p0.05)；与此相反的,用3-MA处理后,卵母细胞的体外受精率升高(p0.05),受精后的异常率则显著下降(p0.05)。最后,在卵母细胞体外老化过程中添加α-硫辛酸后,检测老化卵母细胞的自噬水平,结果表明自噬水平受α-硫辛酸的影响出现了下降。这说明卵母细胞在体外老化过程自噬水平会出现升高,而α-硫辛酸可以抑制其升高的程度,α-硫辛酸可能通过抑制自噬水平的升高来延缓卵母细胞的老化。综上所述,α-硫辛酸通过提高体外受精率、抑制细胞极性的丢失、抑制组蛋白修饰水平和自噬水平的升高来延缓卵母细胞的老化进程。