辅助降血脂益生乳酸菌的筛选及其对高血脂大鼠肠道菌群的影响

【摘要】：血清中的血脂水平过高是引起众多心血管疾病的主要原因。研究表明,降低血清中的血脂水平能够显著降低心血管疾病的死亡率。药物治疗是当前治疗心血管疾病的主要方式,但是药物治疗成本较高,并且具有较大的副作用。乳酸菌作为人体肠道中重要的益生菌,已被证实能够改善血清中的血脂水平,并使肠道微生态系统发生长期而有益的变化,而来源于人体自身的益生菌通常具有较高的安全性,因此本文从广西巴马长寿地区的人群肠道中分离筛选出体外辅助降血脂能力较强的乳酸菌,并研究其在高血脂大鼠体内的降血脂效果以及对高血脂大鼠肠道菌群的影响,从而探索乳酸菌在体内降血脂的可能机制,并为以肠道菌群为靶点进行的益生菌干预治疗提供理论依据。1.利用选择性培养基从广西巴马长寿地区人群采集的粪便样品中分离乳酸菌,通过体外试验筛选出降胆固醇及甘油三酯能力较强的乳酸菌,然后进行模拟人工胃液、胆盐耐受性、抑菌及耐药性试验；并研究其生长菌体、热致死菌体及休眠菌体的胆固醇降解率及其在体外的降胆固醇方式。结果表明,从15份粪便样品中分离获得156株乳酸菌,其中Lp2、S10、Lf7及Hsryfm 1301等16株乳酸菌的胆固醇及甘油三酯的降解率均分别大于30.35%和5.33%, Lp2、S10、Lf7及Hsryfm 1301在pH3.0的人工胃液中存活率均大于63.00%,在含0.1%、0.3%及0.5%胆盐的培养基中存活率均大于15.00%；Hsryfm 1301的抑菌能力较强于Lp2、S10及Lf7.对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为14.67mm、11.35mm及10.67mm；Hsryfm 1301的耐药性低于Lp2、S10及Lf7,对头孢唑啉、头孢拉定、四环素、氯霉素、利福平素均敏感,对链霉素中度敏感,对青霉素G、诺氟沙星及环丙沙星均耐药;Hsryfm 1301在含0.1%、0.3%及0.5%胆盐的培养基中的降胆固醇能力较强于Lp2、S10及Lf7,降解率分别为56.25%、28.91%及13.20%；Lp2、S10、Lf7及Hsryfm 1301的生长菌体、热致死菌体及休眠菌体均能降低培养基中的胆固醇,Hsryfm 1301生长菌体的胆固醇降解率为61.90%,高于Lp2、S10及Lf7；Hsryfm 1301体外降胆固醇的主要方式为菌体吸收及共沉淀,分别占其总降解率的62.50%及36.50%。经API及16S rDNA测序将Hsryfm 1301鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。2.通过饲喂4周高脂饲料来建立高血脂大鼠模型,以降血脂药物血脂康作为阳性对照,研究L. rhamnosus hsryfm 1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳在高血脂大鼠体内的降血脂效果。结果表明,饲喂4周高脂饲料,模型组大鼠血清中的胆固醇(Serum total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglycerides, TG)及低密度脂蛋白(Low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量显著高于对照组(P0.05),分别为2.05mmol/L、1.98mmol/L、0.28mmol/L,表明高血脂大鼠模型建模成功；灌胃4周L. rhamnosus hsryfm 1301发酵乳后,大鼠对饲料的利用率显著高于模型组(P0.05),为29.46%；饲喂8周高脂饲料后,模型组大鼠的肝指数及体脂指数均显著高于对照组及L. rhamnosus hsryfm 1301各处理组(P0.05),分别为3.98和3.55。灌胃4周L. rhamnosus hsryfm 1301的各处理方式后,菌体悬浮液组及发酵乳组大鼠血清中TC、TG的含量显著低于模型组(P0.05),分别为1.50mmol/L、1.30mmol/L及1.53mmol/L、 1.28mmol/L;菌体热致死组大鼠血清中TC、高密度脂蛋白(High density lipoprotein cholesterol, HDL-C)及LDL-C的含量显著低于模型组(P0.05),分别为1.90mmol/L、 0.38mmol/L及0.19mmol/L;菌体破碎液组大鼠血清中TC、TG及LDL-C的含量显著低于模型组(P0.05),分别为1.78mmol/L、1.68mmol/L及0.17mmol/L;灌胃4周的血脂康后,人鼠血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量也显著低于模型组(P0.05),分别为1.76mmol/L、 1.65mmol/L、0.39mmol/L及0.19mmol/L。灌胃4周L. rhamnosus hsryfm 1301的菌体悬浮液、菌体破碲液及其发酵乳后,大鼠血清中氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)浓度显著高于模型组(P0.05),分别为74.96U/mL.73.58U/mL及73.96U/mL,而热致死菌体对大鼠血清中的SOD浓度影响较小；菌体悬浮液组及发酵乳组大鼠粪便中胆固醇、甘油三酯和胆汁酸的含量显著高于模型组(P0.05),分别为10.23μmol/g、4.25μmol/g和28.87μmol/g及9.85μmol/g、4.03pμmol/g和27.13μmol/g;菌体悬浮液组、菌体破碎液组与发酵乳组大鼠粪便中的水分含量显著高于模型组(P0.05),分别为46.15%、45-35%及46.85%；通过透射电镜观察发现,L. rhamnosus hsryfm 1301菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳均能预防由高血脂引起的大鼠肝脏和心脏组织的病变。3.利用聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing gradient gelelectrophoresis, PCR-DGGE)技术研究基础饲料、高脂饲料及L. rhamnosus hsryfm1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳对高血脂大鼠肠道菌群的影响。结果表明,饲喂4周高脂饲料增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌属PCR-DGGE图谱的条带数,降低了肠道微生物16S rRNA基因V3区、拟杆菌属、乳酸菌及双歧杆菌属PCR-DGGE图谱的条带数,而L. rhamnosus hsryfm 1301的各处理方式对大鼠肠道微生物的影响正好与之相反。饲喂4周基础饲料及高脂饲料后,大鼠肠道中Klebsiella pneumoniae及Uncultured bacterium的丰度下降甚至消失,同时增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌的种类,分别为Clostridiumbotulinum A str. Hall、Clostridium pasteurianum BC1、Ruminococcus champanellensis 18P13 、Ruminococcus albus 7及Ruminococcus bromii L2-63,而对照组大鼠肠道中的Uncultured Bacteroidetes bacterium TM1-40肖失。试验第9周,灌胃4周L. rhamnosus hsryfm 1301菌体悬浮液后,大鼠肠道中出现了Pantoea vagans及Clostridium thermocellum,对照组及模型组大鼠肠道中出现了Streptomyces coelicolor及Clostridiales genomo sp.,对照组大鼠肠道中Clostridium botulinum A str. Hall的丰度高于其它组；热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳使大鼠肠道中Ruminococcus bromii L2-63的丰度下降或消失,菌体悬浮液增加了大鼠肠道中Lactobacillus amylovorus GRL的丰度,菌体破碎液增加了大鼠肠道中Lactobacillus buchneri NRRL B-30929的丰度,发酵乳则增加了大鼠肠道中Lactobacillus sp,的丰度；菌体悬浮液、菌体破碎液及发酵乳还增加了大鼠肠道中乳酸菌的种类,分别为Lactobacillus murinus DLM 3108、Lactobacillus gasseri ATCC 33323及Lactobacillus sakei subsp.。4.利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time ploymerase chain reaction, RT-PCR)的方法研究基础饲料、高脂饲料及L. rhamnosus hsryfm 1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳对高血脂大鼠肠道菌群的影响,并分析高血脂大鼠的肠道菌群与其血清血脂水平的相关性。结果表明,饲喂8周基础饲料显著增加了大鼠肠道中拟杆菌和肠球菌的数量(P0.05),饲喂8周高脂脂饲料显著增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌、肠球菌以及肠杆菌的数量(P0.05),同时显著降低了拟杆菌、乳酸菌及双歧杆菌的数量(P0.05);L. rhamnosus hsryfm 1301各处理方式干预4周后,菌体悬浮液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌及乳酸菌的数量(P0.05),并显著降低了柔嫩梭菌的数量(P0.05)；热致死菌体悬浮液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌及肠球菌的数量(P0.05),并显著降低了柔嫩梭菌及肠杆菌的数量(P0.05)；菌体破碎液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌、乳酸菌及双歧杆菌的数量(P0.05),并显著降低了柔嫩梭菌的数量(P0.05)；发酵乳显著增加了大鼠肠道内拟杆菌及肠球菌的含量(P0.05),同时显著降低了柔嫩梭菌及肠杆菌的数量(P0.05)；高血脂大鼠肠道内柔嫩梭菌的数量同其血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量呈显著正相关(P0.05),肠道内乳酸菌及双歧杆菌的数量同肠杆菌的数量呈显著负相关(P0.05)。5.利用高通量测序的方法研究基础饲料、高脂饲料及L. rhamnosus hsryfm 1301菌体悬浮液及其发酵乳对高血脂大鼠肠道菌群的影响,并分析高血脂大鼠的肠道菌群与其血清血脂水平的相关性。结果表明,高脂饲料、L. rhamnosus hsryfm 1301菌体悬浮液及其发酵乳显著改变了大鼠肠道中柯林斯菌属、拟杆菌属、普氏菌属、乳杆菌属、肠球菌属、瘤胃球菌属等22个属的微生物的相对丰度(P0.05)；饲喂8周基础饲料及4周高脂饲料降低了大鼠肠道中微生物物种的丰度及多样性,使得大鼠肠道菌群的Chaol/ACE署Shannon指数显著降低(P0.05),Simpson指数显著增加(P0.05)；而L. rhamnosus hsryfm 1301菌体悬浮液及其发酵乳的干预恢复了大鼠肠道中微生物物种的丰度及多样性,显著增加了大鼠肠道菌群的Chaol/ACE和Shannon旨数(P0.05),并降低了Simpson旨数(P0.05)；同时促进了大鼠肠道中乳杆菌属的繁殖,并抑制了大肠杆菌／志贺氏菌的生长。大鼠肠道中瘤胃球菌属的相对丰度与血清中TG的含量、Dorea spp的相对丰度与血清中TC及LDL-C的含量、肠球菌属的相对丰度与血清中HDL-C的含量均呈显著正相关(P0.05),而丁酸弧菌属的相对丰度与血清中TC及LDL-C的含量呈显著负相关(P0.05)。