精氨酸调控酪蛋白表达途径相关miRNAs的筛选与表达分析

【摘要】：功能性氨基酸——精氨酸(Arg)对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成有一定的促进作用,本课题组前期研究了精氨酸调控乳腺上皮细胞酪蛋白合成途径中的相关因子和其功能基因,在此基础上,本研究将进一步探索精氨酸影响奶牛乳腺酪蛋白表达的miRNA分子机制。研究包括以下四个方面部分。试验一精氨酸途径调控酪蛋白表达miRNA的预测该试验通过PicTar和TargetScan两种可以预测靶定目标基因的网络数据库进行预测筛选,对精氨酸调控酪蛋白合成通径相关功能基因的表达起调控作用的miRNA入手,通过网络数据库预测对精氨酸调控酪蛋白合成通径相关功能基因起调作用的miRNAs。结果显示：通过将两种数据库的预测结果进行比对,筛选出精氨酸调控酪蛋白合成通径中mmu-miR-325、mmu-miR-3062、mmu-miR-471-3等53个候选miRNAs可能对酪蛋白的合成具有调控作用。试验二体外法检测精氨酸途径调控酪蛋白合成的重要miRNAs本试验采用本实验室储备的二代奶牛乳腺上皮细胞,添加精氨酸进行体外培养,根据添加的精氨酸的量分为0倍组、1倍组、2倍组,采用RT-PCR方法检测所筛选出精氨酸调控酪蛋白合成途径相关的候选miRNAs的表达情况。结果显示：所筛选出的候选miRNAs中有9条：mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-101a、mmu-miR-760-3p、 mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p、mmu-miR-468及mmu-miR-875-3p在精氨酸组和对照组间差异显著。提示这9条候选的miRNAs可能对精氨酸调控酪蛋白合成途径中相关功能基因的表达起调控作用进而影响乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。试验三精氨酸灌注对奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表达的影响本试验选择6头体重、胎次(4胎)、泌乳期(80±2d)、泌乳量(21.0±1.0 kg)体况(3.0)等基本一致的荷斯坦奶牛作为试验动物,分3组,分别为：对照组、精氨酸组、丙氨酸组,每组2头试验牛,采用3×3复拉丁方试验设计,进行颈静脉灌注。结果显示：灌注精氨酸组牛奶中乳蛋白含量和乳品质均有提高；酪蛋白的合成量有所提高,CSN1S1、CSN1S2的表达量显著提高；另外,体外法检测出的差异miRNAs中mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、 mmu-miR-574-5p都在精氨酸组较高(P0.05)；但miR-468在精氨酸组较低(P0.05)。提示精氨酸可能通过影响酪蛋白合成途径这8条候选miRNAs表达的机制来影响酪蛋白合成通路相关基因的表达而最终调控酪蛋白的合成。试验四颈静脉灌注精氨酸对泌乳中期奶牛氮代谢及免疫性能的影响本试验主要研究颈静脉灌注精氨酸对奶牛养分消化、氮代谢和免疫性能的影响。试验设计同试验三。结果表明,乳蛋白氮产量在3组之间的差异显著(P0.05),以精氨酸组最高,丙氨酸组次之,对照组最低。乳蛋白氮占摄入氮比例也以精氨酸组最高,但组间差异不显著(P0.05)。代谢氮占摄入氮比例为精氨酸组对照组丙氨酸组。精氨酸组显著提高了血清中免疫球蛋白IgG浓度、血浆中总蛋白的浓度及白蛋白与球蛋白比例(P0.05)；而谷丙转氨酶及谷草转氨酶等指标不受灌注的影响；同时,该组血清中IL-1、TNF-a水平也较高(P0.05)。总结而言：颈静脉灌注精氨酸可通提高奶牛对氮的消化与利用来提高其乳蛋白的合成量；同时提高了奶牛血液中总蛋白、免疫球蛋白IgG及细胞因子IL-1等的水平,有利于提高奶牛机体的免疫能力和胎儿被动的免疫力。