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人源乳酸菌筛选及其对小鼠免疫调节作用的研究

刘东方  
【摘要】:免疫系统是人体自身的防御系统,可以识别和消灭外来侵入机体的任何异物,也可处理衰老、死亡等自身细胞。免疫低下是免疫系统失衡的直接表现,是机体的一种亚健康状态,而乳酸菌及其相关制品具有增强机体免疫力等生理功能。本研究以分离自广西巴马长寿人群肠道中的乳酸菌为研究对象,通过体外试验筛选出耐受性和黏附性较高的乳酸菌,以脾淋巴细胞和巨噬细胞为靶细胞从体外水平研究其对细胞免疫调节活性,并通过小鼠免疫低下模型探讨其在体内对免疫系统的调节效应。主要研究结果如下:1.人源乳酸菌肠道耐受性及黏附能力体外研究。通过测定分离得到的乳酸菌在不同pH的人工胃液、人工肠液及不同胆盐浓度培养基中的存活率以及对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制能力来筛选耐受性及抑菌活性较强的乳酸菌,然后研究它们的表面疏水性、自聚合能力及黏附能力。结果表明,从样品中分离得到119株菌株,将71株初步鉴定为乳酸菌,其中43株乳酸菌的凝乳特性良好、产酸速率中等、后酸化弱;21株乳酸菌在pH为2.0的人工胃液和人工肠液培养3h存活率均大于20%,在胆盐浓度为0.5%培养基中培养24h存活率大于10%;进一步研究发现,共有12株高黏附性乳酸菌表面疏水性大于25%,自聚合百分率大于25%,每个细胞平均黏附菌数大于8个;对表面疏水性、自聚合能力及黏附性进行相关性分析发现,表面疏水性与黏附性呈显著正相关(P0.01),自聚合能力与黏附性呈显著正相关(P0.01)。2.乳酸菌菌体对免疫细胞活性影响的体外研究。通过测定乳酸菌菌体外诱导免疫细胞增殖率、吞噬中性红能力、分泌IL-2、TNF-α及NO水平来研究其对免疫细胞活性的影响。结果表明,12株乳酸菌中对脾淋巴细胞诱导增殖率均大于40%的菌株有LV108、PW1、 RBM7和XJH301,其中菌株LV108对细胞诱导作用最强(P0.05);刺激脾淋巴细胞分泌IL-2含量均大于30.00ng/L的菌株有LV108、T2及XJH301;刺激脾淋巴细胞分泌TNF-a含量均大于34.40ng/L的菌株有LV108、N4、XJH301和W9。对巨噬细胞诱导增殖率均大于40%的菌株有LV108、N4、XJH301和Z9;菌株LV108、PW4和XJH301诱导巨噬细胞吞噬中性红能力与阳性对照组没有显著性差异(P0.05);刺激巨噬细胞分泌NO含量均大于6.80μmol/L的菌株有LV108、Q3和XJH301。通过研究乳酸菌菌体对免疫细胞活性的影响发现,菌株LV108和XJH301对免疫细胞刺激效果及分泌免疫活性物质高于其它菌株,因而对这2株乳酸菌体内免疫调节功能进行进一步研究。3.乳酸菌分离株鉴定及耐药性和益生特性分析。通过测定乳酸菌对庆大霉素、阿米卡星、万古霉素等13种抗生素的药敏性、对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌三种致病菌的抑菌性及抗氧化能力来研究乳酸菌的体外功能特性。结果表明,菌株LV108和XJH301的耐药谱相对较窄,均对新霉素、磺胺异恶唑及链霉素具有耐受性,均对头孢哌酮及头孢曲松中度敏感;均对阿米卡星、万古霉素、卡那霉素及红霉素敏感。菌株LV108对3种致病菌抑菌圈直径分别为21.40±1.53mm、17.50±1.24mm及19.50±1.84mm;菌株XJH301对3种致病菌抑菌圈直径分别为18.33±1.53mm、17.07±0.87mm及20.17±0.71mm。菌株LV108和XJH301发酵液对羟自由基清除率均大于53.00%;对DPPH自由基清除率均大于62.00%;还原能力均大于2.0。对筛选出的免疫调节性能较强、益生特性较好的菌株LV108和XJH301进行API鉴定和16S rDNA序列鉴定发现,菌株LV108为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、菌株XJH301为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。4.乳酸菌对免疫低下小鼠免疫调节作用的研究。通过腹腔注射环磷酰胺来建立免疫低下小鼠模型,以左旋咪(?)药物为阳性对照,研究乳酸菌菌悬液及其发酵乳对机体免疫系统的调节效应。对各组小鼠体重增长速率、脏器指数、血清免疫分子分泌水平进行了比较分析,同时对各组小鼠血清溶血素含量、耳肿胀度、脾淋巴细胞增值率(特异性免疫功能指标)以及巨噬细胞吞噬活性(非特异性免疫功能指标)进行了测定。结果表明,采用连续3天皮下注射80mg/kg的环磷酰胺方法成功的建立了免疫低下小鼠模型,干预组脏器指数、溶血素含量、耳肿胀度等指标显著高于模型组(P0.05);通过乳酸菌干预4周后,发现LV108和XJH301菌悬液组及其发酵乳组小鼠体重增长幅度显著高于模型组(P0.05);其血清IL-2含量分别为163.11ng/L、167.41ng/L、160.1 lng/L、166.18ng/L,其血清IgG含量分别为0.90g/L、0.96g/L、0.85g/L、0.93g/L,均显著高于模型组(P0.05);其血清中的溶血素含量、小鼠廓清指数K和吞噬指数α也均显著高于模型组(P0.05);研究还发现,乳酸菌干预组小鼠脾脏指数及胸腺指数均显著高于模型组(P0.05),且发酵乳组显著高于菌悬液组(P0.05),同时小鼠耳肿胀度和脾淋巴细胞增值率两个指标也发现同样的结果。


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