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水稻茉莉酸和细胞分裂素信号相关基因及QTLqSB-11~(LE)的抗纹枯病功能和机理研究

薛芗  
【摘要】:水稻iOryza sativa)是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一,易遭受病虫害威胁。纹枯病是水稻三大病害之一,在我国南方部分地区已成为水稻第一大病害,每年造成巨大的产量损失。水稻对纹枯病的抗性为典型的数量性状,抗病机制不明,抗病育种中只能利用数量抗病基因,致使水稻抗纹枯病育种进展较慢。本文分析了通过调节水稻自身基因OsOSM1的表达和提高细胞分裂素含量来增强水稻纹枯病抗性的可行性,同时对一个抗纹枯病主效QTL (quantitative trait locus)的功能进行了研究,取得的主要结果如下:1、提高水稻自身基因OsOSMl的表达可增强水稻对纹枯病的抗性本研究组之前通过水稻全基因组芯片鉴定到了一批仅在抗病品种YSBR1中受纹枯病菌诱导表达的抗性相关基因。其中1个基因(LOC_Osl2g38170)位于第12染色体上,无内含子,编码osmotin蛋白,属于PR-5家族,命名为OsOSMl。研究发现,水稻基因组中共存在2个osmotin编码基因,其中OsOSM1主要在孕穗期和叶鞘中高表达,与水稻纹枯病主要危害时期和特点相吻合。纹枯病菌侵染后,OsOSM1在抗病种质YSBR1中快速诱导表达,但在感病品种Lemont和徐稻3(XD3)号中则几乎未见增强表达。在XD3号中,我们对OsOSM1基因进行了超表达,发现相对于未转化对照,OsOSM1超表达系对纹枯病的抗性均有了显著提高,而且发现转基因系中的OsOSM1表达水平总体与其抗病水平呈显著正相关。农艺性状观测结果显示,OsOSM1过高表达会影响水稻的正常生长发育,但是当适当增强其表达水平时,可获得既增强纹枯病抗性又不影响生长发育和产量水平的优良转基因系,暗示OsOSM1具有一定的育种应用价值。OsOSM1蛋白定位于细胞质膜。OsOSM1超表达转基因系中茉莉酸途径(Jasmonic acid/JA)相关标志基因表达显著增强,OsSOMl也受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导表达,这表明OsOSM1超表达系的抗性提高与激活JA介导的防卫信号有关。以上结果表明,OsOSM1在水稻抵抗纹枯病菌侵染中具有重要作用,研究结果为进一步通过转基因策略调节OsOSM1的表达或者从水稻自然资源中筛选OsOSM1高表达种质培育抗纹枯病育种中间材料奠定了基础。2、提高水稻细胞分裂素含量可增强水稻对纹枯病的抗性水稻纹枯病致病菌是一种腐生性真菌,具有典型死体营养型病原菌的侵染特征,即在侵染寄主细胞前通常需要先杀死细胞。前人研究显示,增强细胞分裂素含量(Cytokinin,CK)总体可延缓细胞死亡,减缓植株衰老。我们发现体外喷施CK类物质可增强水稻幼苗对纹枯病的抗性。通过农杆菌介导法,我们将一个由衰老诱导启动子驱动CK合成相关基因IPT的表达载体(PSAG39::IPT)转入感病粳稻品种XD3中,获得了内源CK含量显著提高的转基因株系。转基因系叶片中的叶绿素含量明显提高,衰老延缓。室内离体接种和大田接种结果显示,转基因系对纹枯病的抗性显著增强;相对于未转化对照品种,转基因系在纹枯病菌侵染初期的细胞死亡量明显减少。利用引进的水稻CK脱氢酶基因4 (cytokinin oxidase/dehydrogenases 4, CKX4,参与CK降解)的超表达转基因系,我们发现OsCKX4ox转基因系的叶绿素含量和细胞分裂素水平显著降低;相比于对照品种,OsCKX4ox转基因系对纹枯病的感病程度显著增强,病原菌侵染初期的细胞死亡程度明显加重。我们还发现一个滞绿(衰老显著延缓)突变体YD8-sgr,其在成熟后期,叶片中的叶绿素和CK含量均明显高于野生型对照,呈现滞绿表型;YD8-sgr对纹枯病的抗性显著增强,病原菌初期侵染诱导的细胞死亡程度明显减轻;YD8-sgr突变体中的11个OsCKXs中有10个表达水平显著低于野生型对照,表明YD8-sgr突变体主要是通过降低OsCKXs表达稳定突变体生育后期的CK含量,从而减少纹枯病菌侵染初期的细胞死亡量,最终提高水稻对纹枯病的抗性。以上结果首次阐明CK在调节水稻对纹枯病菌的抗性中具有重要作用,为进一步探讨CK在植物抗病防卫反应中的信号机制提供依据,同时也为水稻抗纹枯病分子育种开辟一条新的思路。3、抗纹枯病QTLqSB-11LE的克隆与功能分析qSB-11的抗性等位基因来自Lemont,命名为qSB-11LE,本研究组前期已将其精细定位在水稻第11染色体上的一个78kb区间内,并通过基因释义、测序和表达分析确定了4个候选基因,分别是编码跨膜氨基酸转运子蛋白基因(ORF1)、受体类蛋白基因(ORF10)、受体类蛋白基因(ORF11)和植保素缺陷型基因4(PAD4)。在此基础上,本研究在Lemont背景下首先对各候选基因进行了RNA干扰(RNAi)研究,纹枯病抗性鉴定结果显示,ORF1、ORF1l和PAD4的RNAi转基因系与对照Lemont处于相似抗性水平,相反ORFl0的RNAi转基因系对纹枯病的抗性显著低于Lemont,初步表明ORF10参与水稻对纹枯病的抗病反应。进一步我们在感病近等基因系NIL-qsb11TQ (Lemont遗传背景,但抗性基因qSB-11LE被回交置换为品种特青(TQ)中的感病等位基因qsb11TQ)背景中分别对候选基因ORF10和ORF1l进行了超表达,抗病鉴定结果显示,ORF10超表达转基因系对纹枯病的抗性水平显著高于对照NIL-qsb11TQ,而ORF11超表达系的抗性水平未见明显改进,说明ORF10是qSB-11LE的最可能候选基因。通过遗传互补试验,我们发现在NIL-qsb11TQ背景中导入ORF10全长基因几乎可恢复NIL-qsb11TQ的抗性,证明ORF10基因即是qSB-11LE。通过测序,我们在82份水稻自然品种中鉴定到编码区存在7种等位变异。通过qRT-PCR,我们发现ORF10在水稻孕穗期和叶鞘中高表达,这与水稻纹枯病主要在孕穗期严重发生且主要危害叶鞘的特点相吻合。ORF10受纹枯病菌诱导表达,但基本不受白叶枯病菌的诱导表达。亚细胞定位结果显示,ORF10蛋白在细胞膜和细胞核中均有定位。通过RNA-seq,我们对ORF1O的RNAi转基因系(10Ri-1)及对照Lemont进行了转录组分析,初步发现ORF10可能参与调控ET (Ethylene, ET)信号;进一步通过qRT-PCR,我们发现纹枯病菌侵染后,ET合成相关基因OsACO7ET信号途径中的标志基因OsEBP89在Lemont中均显著增强表达,但在ORF10的RNAi转基因系10Ri-1、10Ri-2和感病近等基因系NIL-qsb11TQ中则未见明显变化;随后我们测量了ET释放速率,发现在纹枯病菌侵染后24h和48h样本中,Lemont中的ET释放速率均显著高于NIL-qsb11TQ和10Ri-1、10Ri-2。以上结果表明,ORF10是通过影响纹枯病菌诱导的ET合成进而激活ET介导的防卫信号提高水稻对纹枯病的抗性。由于ORF10释义编码受体类蛋白,因此,我们怀疑其类似于已克隆的受体蛋白参与调控水稻的PTI反应或早期抗病反应。为此,我们利用两种已知PAMPs (Microbial-associated molecular patterns)因子chitin(几丁质)和短肽flg22(细菌鞭毛蛋白短肽),分别处理对照Lemont、NIL-qsb11TQ和10Ri-1转基因系的叶片,测定处理后的水稻叶片中还原性氧ROS(Reactive oxygen species)的聚集动态,同时分析了相关信号中的标志基因表达变化。结果显示,chitin处理后,Lemont中的ROS迅速得到聚集,其次是10Ri-1,而NIL几乎不受诱导;flg22处理后,Lemnot、NIL-qsb11TQ和10Ri-1中的ROS聚集量均有一定提高,但在Lemont中的聚集量更高,表明ORF10参与水稻的早期抗病反应。综合以上结果,我们初步提出了ORF10的抗病信号传导机制,即ORF10参与水稻对纹枯病菌的早期抗病反应,并快速诱导ET合成,从而激活ET介导的防卫反应以提高水稻对纹枯病的抗性。


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