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CPEB1基因对山羊卵巢颗粒细胞增殖的调控研究

张昊  
【摘要】:雌性动物的主要生殖器官是卵巢,卵泡是卵巢的主要功能单位,每一个卵泡腔内含有一个卵母细胞以及数量巨大的卵泡颗粒细胞,而卵泡颗粒细胞在维持生殖功能方面有着重要的地位。卵母细胞在排卵前一直被卵泡液包裹,卵泡液的主要组成部分是卵泡颗粒细胞的分泌物和卵泡膜血管渗出液。颗粒细胞分泌的FSH、LH、类固醇等激素,为卵母细胞的生长创造了良好的环境,对卵母细胞的生长有着重要的促进作用,同时也精确的调控着卵母细胞的生长发育。卵泡颗粒细胞成为研究动物生殖生理的一种理想细胞模型。本研究在前期转录组测序基础上,筛选到可能与山羊卵母细胞增殖相关的关键基因CPEB1。以江苏南通本地白山羊为研究对象,构建该基因的过表达载体pcDNA3.1-CPEB1和小分子RNA干扰载体siCPEB1。探究其在山羊卵巢颗粒细胞增殖过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1.山羊CPEB1的克隆、以及构建该基因的真核表达pcDNA3.1-CPEB1载体和小分子RNA干扰载体siCPEB1:利用PCR成功克隆出CPEB1的CDS区,并将其成功克隆至pcDNA3.1载体上,成功构建真核表达载体pcDNA3.1-CPEB1,并且通过酶切及测序鉴定无误;成功合成CPEB1的siRNA片段siCPEB1-1、siCPEB1-2、siCPEB1-3和siCPEE1-NC,其中siCPEB1-3对成年母羊和幼龄母羊卵巢颗粒细胞中CPEB1的干扰活性达到80%以上。2.分别过表达和敲低该基因在山羊卵巢颗粒细胞中的mRNA表达水平,通过qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达水平和使用Western Blot检测相关基因的蛋白表达水平:(1)转染真核表达载体pcDNA3.1-CPEB1进入卵泡颗粒细胞后,CPEB1在成年母羊组mRNA表达水平提高20倍,在幼龄母羊组mRNA表达水平提高16倍。同时,成年母羊组的细胞增殖相关基因CYCLIN B1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别上调10、17、10倍;幼龄母羊组的细胞增殖相关基因CYCLIN B1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别上调11、12、7倍。CPEB1在成年母羊组蛋白表达水平提高1.7倍,CPEB1在幼龄母羊组蛋白表达水平提高2倍,而成年母羊组的增殖相关基因CYCLINB1,CDK1的蛋白表达水平分别上调1.7,1.6倍;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLINB1,CDK1的蛋白表达水平分别上调2,1.5倍。说明过表达CPEB1能够上调增殖相关的CDK1、CYCLIN B1和C-MOS,能有效促进山羊卵巢颗粒细胞的增殖。(2)转染小分子RNA干扰载体siCPEB1进入卵泡颗粒细胞后,CPEB1在成年母羊组mRNA表达水平降低约80%,在幼龄母羊组mRNA表达水平降低约80%。同时,成年母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别下调50%、50%、65%左右;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别下调40%、80%、40%倍。CPEB1在成年母羊组蛋白表达水平降低55%,CPEB1在幼龄母羊组蛋白表达水平下降65%,而成年母羊组的增殖相关基因CYCLINB1,CDK1的蛋白表达水平分别下调35%,40%;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1,CDK1的蛋白表达水平分别下调60%,35%倍。敲低CPEB1能够下调增殖相关的CDK1、CYCLIN B1和C-MOS,能够有效抑制山羊卵巢颗粒细胞的增殖。


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