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特境微生物天然产物抗肿瘤活性筛选及其作用机制研究

万丹  
【摘要】:栖息于特殊生态环境的微生物,如:生活在高温、高寒、高渗、高压等极端环境的微生物、海洋微生物、植物内生菌、动物共生菌、稀有放线菌和粘细菌等,在其生命进化历程中,为适应外部特殊环境,形成特殊的代谢途径,因此,能产生特殊的次生代谢产物,为新药研制提供丰富的先导化合物。前期实验从牡蛎共生球毛壳菌Cglobosu.ML-4、黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012、白茅内生菌Cglobosu.IFB-WQ、海带内生菌Alternariasp.TSJ-HD-1和海洋真菌P.janthinellum HKi-6中分离获得21个天然化合物,本学位论文首先采用MTT法测定了这21个特境微生物天然产物的体外抗肿瘤活性,测试的肿瘤细胞株为人肝癌细胞株SMMC-7721和人胃癌细胞株SGC-7901,阳性对照药为顺铂和5-氟尿嘧啶。结果发现,mytoxin B对SMMC-7721细胞具有显著的增殖抑制作用,IC50值为0.15±0.04 μg.mL-1;guxi-2、penicilone C、penicilone D、H7 和 H8 对 SMMC-7721 细胞有强增殖抑制作用,IC50值分别为 2.15±1.51、11.00±1.40、13.74±2.09、12.13±1.53 和 8.76±1.44 μg·mL-1;myrothecine A、tricycloalternarene 3a、2H-(2E)-tricycloaltemarene 12a、penicilone B 和penicilone A对SMMC-7721细胞有较强的增殖抑制作用,IC50值分别为25.5±1.19、45.81±4.58、49.72±1.13、15.29±1.82 和28.62±4.03 μg.mL-1;chaetoglobosin V 和tricycloalternarene F对SMMC-7721细胞有明显的增殖抑制作用,IC50值为60.5±0.93和80.31±3.84μg.mL-1;其它化合物无明显活性。还发现,化合物guxi-2对SGC-7901细胞有强增殖抑制作用,IC50值为15.21lμg·mL-1。在上述研究基础上,本学位论文进一步研究了活性化合物guxi-2、chaetoglobosin V、mytoxin B和myrothecine A的体外抗肿瘤活性机制。Guxi-2是从黄花蒿内生菌M.roridum中分离获得的一个新环十肽化合物,研究发现,其能浓度依赖性地引起SGC-7901细胞G1期细胞周期阻滞;其能诱导SGC-7901细胞凋亡,50 μg·mL-1时凋亡率为21.91±4.26%;guxi-2能明显降低SGC-7901细胞的迁移速率,50μg·mL-1时划痕宽度没有明显变化,且细胞过膜数量明显下降;guxi-2处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加。结果表明,guxi-2对SGC-7901细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G1期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和降低细胞迁移速率有关,其诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径。Chaetoglobosin V是从牡蛎共生球毛壳菌Cglobosu.ML-4发酵液中分离获得的一个细胞松弛素化合物。研究发现,其能浓度依赖性地引起SMMC-7721细胞G2期细胞周期阻滞;可诱导SMMC-7721细胞凋亡,50μgμg·mL-1时凋亡率达到21.89-±5.52%;chaetoglobosin V处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加,Akt蛋白表达和其磷酸化水平下降。上述结果表明,chaetoglobosin V对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G2期细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt信号通路活性相关。Mytoxin B(倍半萜部分含12,13-环氧基)和myrothecine A(mytoxin B的10,13-碳环衍生物)是从黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012中分离获得的两个单端孢霉烯大环内酯化合物。研究发现,mytoxinB能显著诱导SMMC-7721细胞凋亡,1μg·mL-1时凋亡率就达到 22.62±0.64%,myrothecine A 诱导凋亡作用较弱,50μg.mL-1 时凋亡率仅为 8.85±0.11%;mytoxinB和myrothecineA处理后的细胞中,Bcl-2表达皆下降、Bax表达皆增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达皆增加;还发现,Akt蛋白及其磷酸化水平皆下降,使用PI3K抑制剂LY294002做对照实验发现,这两个化合物与LY294002具有相似的活性,且与LY294002存在一定的协同作用;此外,ERK蛋白表达和其磷酸化水平皆下降,p38蛋白表达和其磷酸化水平皆增加。综上可知,mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt和MAPK信号通路活性相关。


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