鸭胚早期性别鉴定及性别决定候选基因表达的研究

【摘要】：在养鸭业中,鸭雌雄个体间因生理、行为等特性的不同导致在生产性能、饲养管理与经济用途及价值等方面存在巨大差异。在胚胎早期进行性别鉴定或者通过性别控制,提前预知甚至决定动物性别,这将会为养鸭业带来一次巨大的飞跃。本实验以凤头鸭胚为研究对象,通过比较与优化鸭胚胎期全血和尿囊液直接PCR性别鉴定方法,旨在获得一种方便、快捷、无损的早期鸭胚性别鉴定的方法。同时,通过在鸭胚中注射芳香化酶抑制剂(AI)和17β-雌二醇(E2),在性别分化关键时期观察其性腺组织学和形态学变化,成功建立鸭胚性反转模型;采用RT-qPCR方法分析AI和E2诱导的性反转鸭胚中DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1等6个性别决定候选基因在性腺分化发育过程中的表达,探讨鸭性别决定相关基因的作用机制。进一步通过构建SOX9和FOXL2的干扰和过表达载体,检测性别决定关键基因的表达水平变化,为探明SOX9和FOXL2基因在鸭性别分化中功能提供理论依据。主要研究结果如下:1.以鸭胚全血为模板,用常规PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶直接进行PCR扩增,成功鉴定鸭胚性别,该方法同样适用于雏鸭及成年鸭血,但不适用于胚胎尿囊液性别鉴定;以鸭胚E10～E20的尿囊液为模板,应用高保真酶MightyAmp DNA Polymerase直接PCR,E17～E20的尿囊液鉴定出了鸭胚性别。两种方法均可进行直接PCR,无需提取DNA,具有简便、快速、准确特点,但胚胎期全血采样对鸭胚伤害过大,死亡率较高,难以应用于实际生产;而尿囊液属于微创采样,对孵化率影响较小,可在实际生产中推广应用。2.通过性腺组织形态学以及组织切片观察发现:与对照组相比,注射芳香化酶抑制剂能够使鸭雌性个体性别反转成雄性,其影响性别分化的关键时期是在8.5-10.5胚龄,并且能促进公鸭胚性腺的早熟;注射雌二醇组可使胚胎表现性别由雄性反转为雌性,其影响性别分化的关键时期也在8.5-10.5胚龄,并且能促进母鸭胚性腺的早熟。3.鸭胚在外源注入AI后,呈现性别反转,其中,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雌性(ZW)胚胎性腺中表达量均出现上调趋势,表明DMRT1、AMH和SOX9等雄性决定基因与睾丸的形成紧密相关;同时P450arom、FOXL2、SF-1等雌性决定基因的表达量显著降低,与表型一致,表明AI确实能使雌性鸭胚雄性化,且能调控鸭性别决定基因表达。注入E2后发现胚胎表现性别由雄性反转为雌性,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雄性(ZZ)胚胎性腺中表达量都明显降低,P450arom、FOXL2、SF-1的表达量均显著升高。进一步表明DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1有性别决定效应,可能是通过参与性激素的合成,在性别分化后的生殖腺生长和发育过程中产生影响。4.在成功构建鸭SOX9基因和FOXL2基因干扰和过表达载体基础上,发现SOX9基因和FOXL2基因均可以调控性别决定关键基因DMRT1,还可以通过调节,SF-1、AMH以及P450arom基因发挥调控性别作用,另外,SOX9和FOXL2也存在反向调控作用,进一步表明SOX9和FOXL2是决定鸭性别的关键基因。