收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

水稻类病变早衰基因LMES3和LMES4的克隆与功能研究

王小虎  
【摘要】:叶片衰老是一个复杂的生物学过程,通常发生在植物发育的最后阶段,由环境信号和多基因网络参与调控。类病变突变体能自发形成类似于过敏反应的坏死斑,且大多数突变体能表现出对一种或多种病原菌的抗性,是一类研究植物防御反应机制的理想材料。尽管目前对植物叶片衰老和防御反应的分子机理有了一定的研究,但其分子调控网络仍有待进一步丰富和解读,从而为开展水稻分子设计育种,培育抗衰老高产新品种打下基础。本研究通过EMS诱变粳稻品种云稻32(Y32)种子获得两个稳定遗传的类病变早衰突变体,分别命名为:lmes3(lesion mimic and early senescence 3)和 lmes4(lesion mimic and early senescence 4)。经表型鉴定、基因定位与克隆、抗性鉴定及功能分析等相关研究,主要结果如下:1、lmes3突变体苗期地上部表现正常,但根系发育受阻;分蘖早期叶片就出现铁锈斑表型,随着植株的生长,斑点数目增加;进入孕穗期,叶尖开始枯黄,出现早衰表型;抽穗期枯黄从叶尖开始沿着叶边一直延续到叶的底部;成熟期斑点连片存在,衰老加速,叶片全部枯黄,整个植株呈黄褐色直至提前枯死。在苗期和分蘖期对植株进行低温处理时,能诱导lmes3突变体表现出早衰现象。lmes4突变体苗期地上部也表现正常,在分蘖早期叶片出现类似于过敏反应(hypersensitive response,HR)的类病斑,同时整片叶片叶脉间的叶肉部分出现失绿黄化症状,而叶脉仍然保持绿色;到抽穗期时,突变体下部叶片叶尖枯黄加剧,上部功能叶片叶尖开始枯黄并伴有水渍状斑点,整片叶片叶脉间的失绿黄化症加重;成熟期叶尖完全枯黄,叶脉间黄化症连片出现,并从叶尖一直延续到叶中部,直到整片叶片三分之一以上完全枯死;成熟后20d,突变体叶尖完全枯死,但整片叶片还有部分保持绿色,叶片表现为过早衰老。与野生型相比,lmes3突变体的抽穗期晚3d,lmes4突变体的抽穗期晚2d,lmes3和lmes4突变体的株高、结实率及千粒重均显著性降低,而穗长、有效穗数、每穗粒数差异不明显。2、遗传分析表明,lmes3和lmes4突变表型均受单隐性核基因控制。利用图位克隆法,最终将LMES3基因定位在第5染色体P27和P33之间约55kb的物理区间内;将LMES4基因定位在第1染色体M25和M48之间约48kb的物理区间内。通过RGAP(Rice Genome Annotation Project)网站上的注释查询,发现LMES3基因定位的区间包含8个开放阅读框(open reading frame,ORF),测序发现第2开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成了编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)替换成了赖氨酸(Lys),经转基因互补和过表达实验证实其就是LMES3的候选基因。LMES4基因定位的区间包含7个开放阅读框,测序发现第6开放阅读框上发生一个G到A的单碱基突变,造成编码氨基酸由色氨酸(Try)替换成了终止子,导致翻译提前终止,最终造成蛋白质功能缺失。3、LMES3和LMES4为两个未报道控制叶片早衰的新基因。组织特异表达分析表明LMES3基因在各个组织器官均有表达,其中在茎中表达量最高。亚细胞定位分析表明,LEMS3蛋白最终定位于细胞膜上。4、叶绿素含量的下降是叶片衰老的重要生理指标。相关测定结果显示,lmes3和lmes4突变体叶片中叶绿素的含量较野生型均显著下降,这表明两个突变体在生理水平上均已经开始早衰。衰老诱导的SGR(STAY GREEN)基因在调节叶绿素降解代谢的过程中发挥着重要的作用,而 qRT-PCR(quantitative real-time,PCR)也证明 SCG 在lmes3和lmes4突变体的叶片中的表达量均显著上调。此外,lmes3和lmes4突变体的离体叶片在黑暗诱导下均比野生型衰老更为迅速和剧烈,这表明LMES3和LMES4基因的突变加快了叶片衰老。5、叶肉细胞的超微结构显示,lmes3和lmes4突变体的叶绿体中类囊体排列比较紊乱,片层排列不规则,嗜锇颗粒的数量增多,体积增大,颜色加深,且lmes4中叶绿体数目有所减少。这些结果表明LMES3和LMES4基因突变影响了叶绿体的发育,从而导致叶绿素含量显著下降,叶片提前衰老。扫描电镜观察发现lmes4叶片单位叶面积内气孔和周边排列的硅质化爪状突起的数目减少,表明其水分蒸腾作用下降,推测一些随水份吸收和流动的矿质盐类(无机盐)运输减弱,进而导致叶片正常生理活动受阻,造成叶片早衰。6、组织化学染色表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)——超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)在lmes3和lmes4突变体叶片中积累,叶片丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,这些结论充分表明lmes3和lmes4突变体叶片已经发生早衰。为了探索lmes3和lmes4突变体中ROS的代谢过程,检测了野生型和突变体中抗氧化酶过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的酶学活性,其中POD和SOD活性在lmes3和lmes4突变体的叶片中显著升高,而CAT活性则显著降低。POD和SOD活性的升高表明lmes3和lmes4突变体可能在积极地响应H2O2和O2-的积累,而lmes3和lmes4突变体叶片中CAT活性的降低可能不足以清除这些额外的H2O2,致使H2O2大量积累。积累的ROS在lmes3和lmes4突变体的叶片早衰和防御反应过程中发挥着重要的作用。7、qRT-PCR分析表明,在lmes3和lmes4突变体叶片中,衰老相关的标志基因Osl2和Osl85,相关的转录因子OsWRKY23和OsNAC2表达均上调,光合系统相关基因rbcS、lhcA、lhcB表达均下调。这些结果在分子水平上证实了 lmes3和lmes4突变体的叶片发生了早衰。8、接种白叶枯病菌浙173(Z173)后,野生型Y32植株表现出典型的白叶枯病发病症状,而突变体植株却显著提高了对白叶枯病的抗性。qRT-PCR分析发现防御反应相关基因PR1a、PBZ1和OsWRKY45的表达量在lmes3和lmes4突变体叶片中均显著上调。这些结果表明,LMES3和LMES4基因突变可激活植株防御反应,进而增强抗白叶枯病的能力。上述结果表明LMES3和LMES4基因突变可导致叶片早衰和防御反应的产生,ROS(02-和H2O2)可能参与了这两个生物学过程。其中,水稻LMES3的编码蛋白是一个多功能蛋白,在叶片早衰、防御反应及非生物胁迫途径中扮演着重要作用,其生化作用机制仍有待进一步研究。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 马燕斌;王霞;张树伟;李换丽;吴霞;王新胜;;棉花突变体种质资源创制概述[J];山西农业科学;2018年01期
2 李新鹏;李京琳;陈小朋;曾翔;龙湍;安保光;张维;吴永忠;黄培劲;;玉米突变体库创制及雄性不育突变体鉴定[J];玉米科学;2018年03期
3 孙玉龙;朱欣欣;何瑞士;李俊畅;安俊航;焦志鑫;姜玉梅;李巧云;牛吉山;;EMS诱导的盛农1号小麦突变体筛选与鉴定[J];麦类作物学报;2018年07期
4 牛丹丹;靳晓;吴海洋;刘晓光;林娟;叶秀云;;解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶高活力突变体的创建与性质研究[J];食品与发酵工业;2017年10期
5 潘俏;张舒癑;沈迪;吴家琪;陈春莲;陈洁;陈劲枫;娄群峰;;黄瓜耐盐突变体材料的筛选与鉴定[J];南京农业大学学报;2018年01期
6 张亚芳;潘存红;李爱宏;汤雯;武茹;陈宗祥;许爱霞;潘学彪;;提高水稻插入突变体库利用效率的尝试[J];遗传;2007年07期
7 薛霏雯;董中东;崔党群;陈锋;;小麦品种偃展4110低能离子束突变体库的初步建立及籽粒硬度突变体筛选[J];麦类作物学报;2014年07期
8 纪策;刘源;李丹;Sossah Frederick Leo;杨阳;付永平;李玉;;有害疣孢霉Hypomyces perniciosus遗传转化体系的建立及其突变体库的构建[J];菌物学报;2018年08期
9 张习春;鲁菲菲;吕育松;罗荣剑;焦桂爱;邬亚文;唐绍清;胡培松;魏祥进;;两个垩白突变体的鉴定及突变基因的图位克隆[J];中国水稻科学;2017年06期
10 岳丽晓;李登云;张玲玲;;拟南芥衰老相关突变体lsm3的鉴定和基因克隆[J];赤峰学院学报(自然科学版);2017年20期
11 王萌;易涛;门淑珍;;拟南芥突变体表型分析在本科实验教学中的应用[J];生物学通报;2017年11期
12 许乐峰;许昕阳;张欢;赵志刚;郑天慧;赵婕妤;曾召琼;刘喜;陈赛华;万建民;;水稻晚开花突变体lft1的鉴定与基因克隆[J];南京农业大学学报;2018年01期
13 张莉;李赞堂;王士银;麻艳超;东方阳;李学勇;徐江;;水稻氮素吸收低效型突变体osnad1的生理和遗传分析[J];作物杂志;2018年03期
14 陈大清;钟育海;李应生;苏爱国;朱云芬;李亚男;;拟南芥耐硒突变体的鉴定及基因定位[J];湖北农业科学;2018年02期
15 曾晓芳;黄仁权;陈锡;李岩;李建容;赵德刚;;贵州地方粳稻‘黎平杂边禾’矮秆小粒突变体dss1鉴定与基因定位[J];植物生理学报;2018年07期
16 刘子文;胡曼曼;王致远;张瑜竣;谷晗;游佳;王益华;江玲;刘玲珑;;水稻心白突变体whc的理化性质和基因定位[J];南京农业大学学报;2018年02期
17 于艳芳;刘喜;田云录;刘世家;陈亮明;朱建平;王云龙;江玲;张文伟;王益华;万建民;;水稻粉质胚乳fse3突变体的表型分析及基因定位[J];中国农业科学;2018年11期
18 郑伟;贾晓曼;王玉珂;王怡霖;孙庚午;何邦令;刘会香;;Botryosphaeria dothidea突变体库的构建及分析[J];山东农业大学学报(自然科学版);2017年01期
19 刘艺;朱小品;刘喜;田云录;刘世家;王云龙;张文伟;江玲;王益华;万建民;;水稻胚乳粉质突变体flo9的表型分析和基因定位[J];南京农业大学学报;2018年04期
20 陈新兵;黄荣峰;王娟;;水稻矮杆突变体D814基因图位克隆与功能分析[J];生物技术进展;2017年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张亚芳;潘存红;李爱宏;汤雯;武茹;陈宗祥;许爱霞;潘学彪;;提高水稻插入突变体库利用效率的一点尝试[A];江苏省遗传学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
2 刘基生;;玉米突变体库的构建及其在玉米功能基因组学中的应用[A];第一届全国玉米生物学学术研讨会论文汇编[C];2015年
3 倪永静;胡新;任德超;李巧云;牛吉山;;国麦301突变体库构建初报[A];中国作物学会2013年学术年会论文摘要集[C];2013年
4 熊宏春;郭会君;谢永盾;赵林姝;古佳玉;赵世荣;李军辉;刘录祥;;航天诱变耐盐小麦突变体的耐盐胁迫关键代谢途径及相关基因研究[A];2017年中国作物学会学术年会摘要集[C];2017年
5 尹梦娇;王艳胜;乔玲;张腾;温贺;李莎莎;张汝;路雅洁;王爱萍;董琦;贾举庆;杨珍平;高志强;郑军;张春来;;旱地小麦品种长6878突变体的诱导、鉴定与遗传分析[A];2017年中国作物学会学术年会摘要集[C];2017年
6 姚姿婷;蓝秀万;周燕;周辉;商巾杰;陈保善;;大规模板栗疫病菌突变体库的构建[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
7 郭冬;张健;常玉晓;陈志辉;陈国兴;吴昌银;王石平;张启发;;构建水稻T-DNA插入突变体库侧翼序列数据库开展反向遗传学研究[A];湖北省遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
8 刘文婷;高友军;腾峰;史卿;郑用琏;;Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价[A];湖北省遗传学会、江西省遗传学会2006年学术年会暨学术讨论会论文摘要集[C];2006年
9 李广悦;丛培乾;宫瑞;姚培圆;冯进辉;Peter Lau;吴洽庆;朱敦明;;单胺氧化酶的半理性设计及在手性胺合成中的应用[A];第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2017年
10 范海燕;李燕;汝津江;王琦;;枯草芽孢杆菌9407菌株突变体库的筛选以及生物膜形成相关基因的鉴定[A];中国植物病理学会2015年学术年会论文集[C];2015年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 高冬丽;黄瓜ACO2和SCL1基因的克隆和功能研究[D];中国农业科学院;2017年
2 谭翀;大白菜核基因雄性不育突变体ftms的鉴定[D];沈阳农业大学;2018年
3 王小虎;水稻类病变早衰基因LMES3和LMES4的克隆与功能研究[D];扬州大学;2018年
4 杜柏娟;int突变能够增强不同温度下抗病基因诱导的生长缺陷[D];四川农业大学;2013年
5 王文强;细胞分裂素代谢在小麦滞绿突变体tasg1中的作用及调控机制[D];山东农业大学;2018年
6 于彦春;水稻矮杆、脆茎突变体dwb1的定位及水稻白叶枯病抗性的遗传机理研究[D];浙江大学;2004年
7 朱世华;T-DNA插入导致苗期短根的水稻突变体研究[D];浙江大学;2004年
8 汪得凯;三个与水稻株型相关突变体的鉴定与基因克隆[D];中国农业科学院;2005年
9 李付振;一个水稻早衰突变体pse(t)的遗传分析、定位及生理学研究[D];浙江大学;2005年
10 周祥胜;一个水稻黄叶突变体的光合、遗传和农学特性研究[D];浙江大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曾娟;拟南芥花干细胞发育突变体ags16的表型分析与基因定位[D];湖南农业大学;2017年
2 徐金龙;拟南芥发育缺陷突变体的筛选、克隆与功能研究[D];西北农林科技大学;2018年
3 郭瑶琳;拟南芥气孔应答气候因子相关突变体的筛选及鉴定[D];天津农学院;2014年
4 刘加哲;拟南芥两个光敏感突变体的图位克隆[D];山东农业大学;2017年
5 王建平;水稻脆性感病突变体bc-sub1的遗传分析与基因定位[D];四川农业大学;2017年
6 聂术君;玉米穗轴扁平突变体的鉴定及基因定位[D];四川农业大学;2017年
7 杨艳丽;水稻矮杆小粒突变体d502(t)和无叶脉突变体dl8636(t)的遗传鉴定及候选基因分析[D];四川农业大学;2016年
8 马芙蓉;水稻黄绿叶突变体577ys的基因克隆[D];四川农业大学;2017年
9 吴慧玉;基于转录组测序分析小麦黄绿突变体Ygm叶色形成候选基因[D];西北农林科技大学;2018年
10 吴迎迎;水稻类病变Lmm-t突变体表型鉴定与遗传机制[D];浙江师范大学;2017年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 王丹;我国建成大型小鼠基因突变体库[N];健康报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978