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水稻纹枯病菌内切葡聚糖酶基因EG146的克隆与表达

陈煜文  
【摘要】:作为水稻三大病害之一,纹枯病在世界各水稻产区均有发生。引起该病的病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn),其腐生性强,主要通过分泌胞壁降解酶和毒素破坏寄主细胞壁,从而杀死寄主细胞并获得自身生长发育所需要的养分,帮助其在寄主体内扩展。由于水稻纹枯病菌遗传转化体系尚未建立,有关该病菌的具体致病机制还少有人研究。为明确该菌胞壁降解酶在其致病过程中的作用,本研究以立枯丝核菌YN-7为研究对象,克隆了其内切葡聚糖酶EG146基因,并对该基因的致病性和编码产物的功能进行了初步研究,结果如下:从水稻纹枯病菌YN-7菌株中克隆了一个糖苷水解酶第16家族内切葡聚糖酶基因EG146。该基因全长1565 bp,含有9个外显子和8个内含子,ORF大小为1125bp,编码374个氨基酸,其信号肽为前19个氨基酸,而成熟肽则包括一个几丁质结合结构域(23~70位氨基酸)和一个催化活性结构域(92~305位氨基酸)。生物信息学预测表明,该基因编码产物理论分子量约为39 kDa,含有跨膜结构域,且主要由胞内分泌至胞外;其三级结构为β-三明治结构,符合内切葡聚糖酶的结构特征。将EG146基因连接至原核表达载体pET-28a,并转化至Rosetta感受态细胞。经IPTG诱导表达发现,目标蛋白并未出现在培养液上清,而是出现在菌体破碎后的上清中,且表达量较小,产物亦无内切葡聚糖酶活性。将该基因转至毕赤酵母GS115与KM71中进行真核表达,表达产物亦存在于菌体破碎后的上清中,其分子量与预测的大小一致,经测定其酶活为22.3 U/mL。这些结果说明,EG146基因虽可以在大肠杆菌和毕赤酵母中表达,但均不能被分泌至胞外;源自毕赤酵母中的表达产物具有活性,而源自大肠杆菌的表达产物可能在表达过程中未被正确折叠,不具有酶活性。将EG146基因构建至瞬时表达载体,并转化至农杆菌GV3101中。将含目的基因的农杆菌液(109 cfu/mL)注射至三生烟、本氏烟、番茄和辣椒等叶片,发现只有三生烟出现大面积的细胞坏死,而其它植株均未产生病状;DAB染色后,表现症状的三生烟叶片出现大量棕褐色颗粒并且沿叶脉迸发,未处理或注射含空载体农杆菌处理的叶片仅有少量棕褐色颗粒,说明EG146基因可起三生烟的过敏性坏死反应。测定表现症状的三生烟叶片电导率,结果显示,无论是四叶期还是八叶期,处理组的电导率均是对照的2.5倍左右,说明EG146基因可引起三生烟叶片细胞受损、电解质外渗和烟叶坏死,并引起植株产生过敏性坏死反应。提取叶片总蛋白进行SDS-PAGE检测,与对照相比,处理叶在55 kDa左右有一蛋白条带明显变细,经飞行质谱检测和数据库比对显示该蛋白为1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco),推测EG146通过一种未知途径引起Rubisco酶的含量变化,进而影响植物对二氧化碳的固定作用。至于EG146基因引起三生烟细胞中Rubisco酶量减少的原因,EG146在植物细胞中的受体以及其在病菌致病过程中的具体作用,均还有待进一步研究。


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