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基于核酸分子水平鉴定肉及肉制品中动物种源成分

史莹莹  
【摘要】:民以食为天,“舌尖上的安全”是重大民生问题,肉及肉制品掺假一直是群众关注的焦点。随着掺假成分的复杂化和香精香料的多样化,依靠感官鉴定、显微镜鉴别以及蛋白质水平的方法来鉴定动物种源成分显得很困难。目前肉类缺乏标准的动物源性食品溯源体系,相关法律不健全,掺杂掺假肉频繁发生。为保障消费者生命安全,迫切需要建立起一套畜禽肉及肉制品的准确、方便的掺假鉴定方法,本研究基于核酸分子水平建立起常见畜禽肉类种源的常规PCR鉴定方法、掺杂肉类的四重PCR鉴定方法以及肉制品中羊肉、牛肉成分量化的实时荧光PCR方法。为食品安全相关部门制定动物源性成分鉴定的标准提供依据。1.常见畜禽肉类种源常规PCR鉴定方法:基于常见猪(Susscrofa)、牛(Bos taurus)、羊(Ovisaries)、鸡(Gallus gallus)、鸭(Anatinae)线粒体基因序列,用 Primer Premier 5.0软件设计筛选出五个物种特异性引物,其产物大小分别为388bp、109bp、399bp、364bp、254bp。优化PCR反应体系和条件后,将五个物种扩增产物双向测序,经过Blast比对分析,同源性均大于97%。各引物在猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、马、大鼠、去离子水的模板下有唯一扩增,条带清晰,特异性良好。其中猪、羊、鸭DNA模板最低检测限为0.5ng/μL,牛、鸡DNA模板最低检测限为5ng/μL,所设计的引物灵敏度高,满足对常见五种畜禽肉的种源鉴别。抽取市售的牛羊肉制品进行检测,市售的牛羊肉制品中存在用低廉的鸭肉混入掺假售卖现象。2.掺杂肉类四重PCR鉴定方法:以大鼠、鸡、鸭、马线粒体COX 1为靶位基因,设计筛选出四对特异性良好的Omega PCR引物,在对引物特异性验证、多重PCR体系和反应程序的优化后,建立起一次性鉴定大鼠、鸡、鸭、马四物种的四重PCR体系。四个物种经过扩增的产物片段大小分别为642bp、204bp、512bp、334bp,与目标片段大小一致,同源性也在97%以上。各引物之间和模板之间干扰均比较弱,单重、二重、三重、四重模板该体系均适用,体系模板灵敏度达1ng/μL,四重体系重复性良好。该体系在同一反应管可以达到多物种检测的目的,节约时间和成本,经济高效。3.肉制品中羊肉、牛肉成分量化的实时荧光PCR方法:分别以羊和牛细胞色素b基因序列设计特异性引物,以16S rRNA为内参基因设计通用引物,考察引物特异性、灵敏度以及内参基因的通用性。实时荧光体系扩增呈典型“S”型曲线且指数扩增期明显,羊源性成分检测限达16pg/μL,牛源性成分检测限达0.64pg/μL,实时荧光定量PCR法灵敏度更高。将不同羊(牛)肉质量百分比的混合肉样DNA为模板扩增,建立起标准曲线,羊(牛)肉质量百分比的对数值与之对应的循环阈值差值△Ct之间呈良好线性关系(R2均大于99%),具有良好的扩增效率。为评价标准曲线可靠性,对已知含量的混合羊(牛)肉样进行回收率检测。回收率在93.07-106.20%之间,回收率较为理想,证实该实时荧光定量PCR法方法适用于对羊肉和牛肉成分含量的量的检测。抽取市售的牛羊肉制品进行检测,存在牛、羊肉成分含量参差不齐的现象。


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