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铁硫纳米酶调控秀丽线虫固有免疫的研究

费承鑫  
【摘要】:秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为模式动物在生命科学的发展中有着重要的地位。秀丽线虫因其结构简单、生命周期短、遗传操作方便、通体透明等特点,已广泛应用于神经系统、衰老机制及细胞程序性死亡的研究。与高等生物不同,秀丽线虫缺少适应性免疫途径,只有固有免疫途径在抗病原菌、抗氧化应激等方面发挥重要的作用。其体内的转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、细胞程序性死亡(programmed celldeath,PCD)、胰岛素/胰岛素样生长因子(insulin/IGF-1)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)4 条免疫相关信号转导途径在不同的环境发挥着主要作用。同时,秀丽线虫的固有免疫系统在进化中有许多保守之处,这为高等生物的免疫机制研究提供了新思路。纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能,又有类似天然酶的催化效率和酶促反应动力学的人工模拟酶。纳米酶的发现,揭示了纳米材料内部新的生物学特性。其较好的经济性,高催化活性,并且具有模拟酶的稳定性,让纳米酶研究迅速成为研究热点。目前,纳米酶在医学、化学、物理等不同领域都有不同程度的交叉研究。纳米酶的研究种类繁多,按材料组成可以将纳米酶分为碳基纳米酶、金属氧化物纳米酶、金属纳米酶以及复合纳米酶。在医学治疗领域,纳米酶可以强力有效的杀伤肿瘤细胞,纳米酶的抗菌效果也是最近几年的研究热点之一。然而有关铁硫纳米酶在生物医学领域的研究尚未成熟,且纳米酶的生物安全性评估远远跟不上其研发的速度。而大多数实验都停留在体外实验,有一定的局限性,所以选择一个很好模式动物作为体内实验对象是亟待解决的问题。本文旨在制备铁硫纳米酶,采用秀丽线虫作为研究对象进行体内研究,探究铁硫纳米酶对秀丽线虫固有免疫的影响。并且通过线虫突变株系,进一步探究铁硫纳米酶影响线虫固有免疫的机制,了解线虫如何调节自身免疫,达到保护其自身的效果。一、铁硫纳米酶的制备采用溶剂热合成法制备铁硫纳米酶,配制成水溶液,通过扫描电镜观察铁硫纳米酶微观结构、尺寸,对纳米酶元素分析,本实验成功合成粒径在100nm左右的铁硫纳米酶。二、铁硫纳米酶对秀丽线虫免疫表型的影响通过将合成好的铁硫纳米酶与大肠杆菌食物混匀涂布NGM培养基上,培养秀丽线虫的野生株系(N2),发现秀丽线虫对纳米酶存在轻微躲避行为,但随着食物的摄入,进入体内并随着时间的延长渐渐将纳米酶代谢排出体外。即使用较高浓度(4mg/mL)的铁硫纳米酶处理秀丽线虫,对其生存率影响不大,说明具有较好的生物相容性。铁硫纳米酶处理线虫48h后,结果发现,纳米酶对秀丽线虫免疫表型产生影响,秀丽线虫寿命延长,产卵数量和体长发育降低。不同浓度的纳米酶(0.1-2 mg/mL)处理后,线虫体内的ROS随着浓度的增加而增高,进一步对秀丽线虫ROS水平持续检测,1.5mg/mL浓度纳米酶处理的线虫和对照组线虫在初期前5天的ROS水平都随时间增加而增高,但铁硫纳米酶处理的线虫,其体内ROS水平在第6天后远远低于对照组水平。同时检测了秀丽线虫体内的SOD水平,发现经过铁硫纳米酶处理后,秀丽线虫体内SOD水平提高了,说明提高了秀丽线虫体内的抗氧化能力。另外,采用同等粒径的Fe3O4纳米颗粒作为实验对照,发现该纳米材料对秀丽线虫的各项免疫表型影响不大。三、铁硫纳米酶对秀丽线虫固有免疫影响的机制研究用铁硫纳米酶处理秀丽线虫后,对筛选的固有免疫相关基因表达进行检测。结果显示,铁硫纳米酶处理的秀丽线虫,其固有免疫的相关基因表达发生明显变化,其中acdh-1、daf-2、daf-16、daf-18基因表达下降,而lys-7和pdk-1基因表达上调。采用胰岛素通路重要因子daf-2(e1370)、daf-16(zls356 Ⅳ)、daf-18(e1375)突变的线虫株系和pdk-1(mg142)、lys-7(ok1384)、acdh-1(ok1489)突变的株系进一步探讨,结果显示,铁硫纳米酶对秀丽线虫固有免疫产生影响,秀丽线虫有可能通过胰岛素通路、调节自身肠道免疫和抗菌肽合成来影响线虫体内代谢,从而抵抗外界环境变化,提高自身的免疫能力。本研究为铁硫纳米酶在秀丽线虫的体内固有免疫研究提供了实验依据。


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