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毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究

高阳  
【摘要】:鸡球虫病是由顶复门(Apicomplexa)、艾美耳属球虫(Eimeria)寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,其中毒害艾美耳球虫(E.necatrix)是鸡球虫病的主要病原,主要危害8~18周龄的青年鸡,可引起鸡的急性小肠球虫病,导致育成鸡的大批死亡。近年来,随着饲养周期相对较长的黄羽鸡饲养量不断攀升,以及鸡球虫病活疫苗的使用,毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。目前鸡球虫病的防治主要依赖药物,但随着耐药性虫株、药物残留肉蛋、病原污染环境等问题的出现,迫切需要寻找一种有效、安全的方法来替代抗球虫药。艾美耳球虫为单宿主寄生虫,其发育经历孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段。孢子生殖在外界环境中进行,形成具有感染性的孢子化卵囊。裂殖生殖和配子生殖在鸡肠道上皮细胞内进行,最终形成未孢子化卵囊,并随鸡粪便排出体外。孢子化卵囊被鸡食入后,释放出孢子囊,后者在肠道中释放出子孢子。子孢子入侵肠上皮细胞,进行裂殖生殖,产出裂殖子,后者再次侵入肠上皮细胞,开始新一轮的裂殖生殖。经2~3代裂殖生殖后,裂殖子进入配子生殖。由此可见,子孢子与裂殖子入侵宿主细胞是球虫建立和完成寄生生活的关键点。鉴定与解析参与这些关键点的分子及其作用机制,将有助于发现防控鸡球虫的新策略。迄今,关于顶复门原虫入侵宿主细胞的关键分子和机制主要来源于对疟原虫(Plasmodium spp.)和弓形虫(Toxoplasma gondii)的研究,对艾美耳球虫的研究甚少。本文通过对毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组学和蛋白质组的比较分析,鉴定差异表达基因和差异表达蛋白,筛选虫体入侵相关分子,并选择关键基因进行原核表达和功能分析,研究结果将有助于阐明球虫入侵宿主细胞的分子机制以及发现药物治疗靶点或疫苗候选抗原。一、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学比较研究分离纯化未孢子化卵囊(UO)、子孢子(SZ)和第二代裂殖子(MZ-2),分别提取RNA,构建测序文库,进行高通量测序。基于PacBio平台三代全长转录组测序,UO、SZ 和 MZ-2 分别获得 9 305 110、8 423 031、6 756 870 条 Subreads,34 932、23040、21 923条转录本,4949,4254,4007个基因;UO发生3’端可变剪接基因数目最多(27.5%),SZ 和 MZ-2 发生 5’端最多(19.09%、23.93%);UO、SZ、MZ-2 的 mRNA3’端分别有955、797、840个基因含有单个poly-A位点;分别鉴定到1958(UO)、1743(SZ)、1416(MZ-2)个新基因,26810(UO)、17804(SZ)、17151(MZ-2)个新转录本;转录因子分析显示,UO、SZ和MZ-2分别有194、159和84条转录本支持10个、11个和8个转录因子家族;在UO、SZ、MZ-2中,分别鉴定到5223、3581、2039条长链非编码RNA,3835、4019、2588个融合转录本。基于Illumina平台二代转录组学测序,分别获得 71 298 596(UO)、73 222160(SZ)和 70203 690(MZ-2)条 Raw reads,8376(SZ vs UO)、6905(SZ vs MZ-2)和 7902(MZ-2 vs UO)个差异表达基因;GO富集分析显示,在SZ vs UO间有6237个DEGs显著富集到113条GO条目,在SZ vs MZ-2间有5076个DEGs显著富集到9条GO条目,在MZ-2 vs UO间有5833个DEGs显著富集到102条GO条目;KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有664个DEGs显著富集到13条信号通路,在SZ vs MZ-2间有1324个DEGs显著富集到31条信号通路,在MZ-2 vs UO间有987个DEGs显著富集到14条信号通路。筛选获得了123个差异表达基因与子孢子入侵宿主细胞相关,50个基因在SZ阶段上调表达,73个基因在UO阶段上调表达。二、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学比较研究分别提取UO、SZ、MZ-2的总蛋白,采用iTRAQ定量标记,进行蛋白质组学测序。共鉴定到983 835个二级谱图,26 410条肽段,3606个蛋白。用GO、KEGG、IPR、KOG四个数据库注释,分别获得1725、2143、2386、1724个蛋白。蛋白差异分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间分别鉴定到388、300、592个差异蛋白(DEPs)。GO富集分析,在SZ vs UO间有166个DEPs显著富集到38个GO条目,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显著富集到20个GO条目,在MZ-2 vs UO间有200个DEPs显著富集到11个GO条目。KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有89个差异蛋白显著富集到102条信号通路,在SZ vs MZ-2间有52个DEPs显著富集到72条信号通路,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显著富集到125条信号通路。差异表达蛋白结构域富集分析显示,在SZ vs UO间有47个DEPs富集到66个结构域,在SZ vs MZ-2间有32个DEPs富集到43个结构域,在MZ-2 vs UO间有64个DEPs富集到84个结构域。差异表达蛋白互作分析显示,在SZ vs UO间有273个蛋白686条蛋白互作反应线,在SZ vs MZ-2间有153个蛋白230条蛋白互作反应线,在MZ-2 vs UO间有321个蛋白864条蛋白互作反应线。筛选获得了 103个差异蛋白与虫体入侵相关。三、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组联合分析基于转录组和蛋白组的联合分析结果显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间转录组和蛋白组表达量person关联系数分别为0.086、0.297和0.317;在mRNA水平与蛋白水平上,关联基因除表达趋势一致外还存在多种表达模式。对转录组和蛋白组相互关联的差异表达基因分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间的差异表达基因数分别为292、159和391个,这些差异表达基因富集到核酸结合、小分子结合、转移酶活性、辅因子结合、氧化还原酶活性等GO条目,参与内质网中蛋白质加工、氨酰基tRNA的生物合成、谷胱甘肽代谢、丙酸酯代谢、碳代谢、氨基酸生物合成、过氧化物酶体等信号通路。筛选获得了 68个关联的差异表达基因与虫体入侵相关。四、毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析用RT-PCR克隆3个虫体入侵相关差异表达基因—表面抗原基因(EnSAG)、P25蛋白基因(Enp25)和微线体蛋白13基因(EnMIC13),并用pET28a(+)载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达。重组蛋白rEnSAG、rEnp25和rEnMIC13 大小分别为 26 kDa、23 kDa 和 19 kDa,其中 rEnSAG 和 rEnMIC13 以包涵体形式存在,rEnp25表达于上清。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗血清。Western blot检测显示,3种重组蛋白均被6 × HIS标签单抗和鼠抗血清特异性识别。用鼠抗血清检测MZ-2中天然蛋白,结果均检测到天然蛋白。免疫荧光定位结果显示,EnSAG蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内,Enp25蛋白分布在SZ虫体一端和MZ-2胞质内,EnMIC13蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内。实时荧光定量PCR检测显示,EnSAG基因在SZ高表达,Enp25基因在UO高表达,EnMIC13基因在MZ-2高表达。Western blot检测蛋白表达量显示,EnSAG蛋白和Enp25蛋白在SZ和MZ-2均高表达,且在MZ-2表达量最高;EnMIC13蛋白仅在MZ-2表达,但表达量相对较低。五、重组蛋白rEnSAG、rEnP25和rEnMIC13的免疫保护效果评价将3种重组蛋白分别与佐剂混合后,制备免疫原。每种蛋白分别设高、中、低(200、100、50 μg/羽)三个剂量组,同时设未免疫攻虫组(阳性对照组)和未免疫未攻虫组(阴性对照组)。二免后7d,除阴性组外,其余各试验组攻虫。以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,rEnSAG中剂量组、rEnp25高剂量组和rEnMIC13高剂量组的免疫保护效果较好,与阳性对照组相比,免疫组的病变记分降低,卵囊产量减少,平均增重增加。


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