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APEC E058株tolA基因缺失株生物学特性及其外膜囊泡免疫保护效力的初步研究

苏森燕  
【摘要】:禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是导致禽类发病的常见病原菌,能够引起以败血症、广泛组织炎症为特征的禽大肠杆菌病,严重危害养禽业,造成巨大的经济损失。滥用抗生素导致APEC多重耐药菌株的大量增加,依赖抗生素为主的防治手段面临很大的挑战。利用非药物途径防控APEC是未来发展的必然趋势,而疫苗接种是防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要手段。外膜囊泡(Outer Membrane Vesicless,OMVs)是由革兰阴性菌和部分革兰阳性菌分泌的一种纳米级(20-200 nm)的球形磷脂双层泡状结构,其包裹细菌多种组分,如外膜蛋白,周质蛋白,磷脂分子,脂多糖,核酸等,具有良好的免疫原性和佐剂活性,能有效刺激宿主免疫系统,因而具备开发成新型疫苗的潜力。前期研制基于OMVs的疫苗中发现,APEC野生型菌株在生长中所分泌的OMVs产量偏低。研究报道位于Tol-Pal系统中的tolA基因,在维持细菌外膜稳定性、影响OMVs产出方面发挥着作用,如tolA缺失后能显著增强鲍氏志贺菌4型菌株OMVs的产量。目前,对于tolA基因在APEC中发挥的功能以及对于OMVs产出的影响未见报道。因此,本研究以APEC O2型强毒株E058为亲本,构建了tolA基因缺失株,研究tolA基因对于APEC生物学功能以及OMVs产量的影响,并对其介导的OMVs的免疫保护效力进行初步评价,为开发基于OMVs的新型疫苗提供参考。1 APEC E058株tolA基因缺失株的构建及其生物学特性研究以APEC E058株为亲本,经λRed同源重组技术构建tolA基因缺失株,并将tolA回补构建回复株,对野生株、缺失株和回复株的生物学特性进行比较。生长曲线测定显示,ΔtolA缺失株与野生株在相同培养条件下的生长速度没有差异;透射电镜观察发现缺失株细胞膜表面明显变薄,表面结构不完整;血清杀菌试验结果显示,AtolA缺失株在不同血清浓度(0.5%-25%)下的抗补体杀菌能力显著下降;穿刺半固体培养基观察运动性试验结果显示,在缺失tolA基因后,菌株的运动性明显降低;HD11巨噬细胞吞噬试验结果显示,ΔtolA缺失株在HD11细胞中的存活能力显著下降;半数致死率(50%Lethal Dose,LD50)毒力评价显示,与野生株相比,ΔtolA缺失株的毒力降低了 100倍左右,而回复株毒力恢复至野生株水平;21日龄SPF鸡体内定殖试验结果显示,ΔtolA缺失株在心血、肝脏和肺脏中定殖能力显著下降,表明tolA基因对于APEC E058株的毒力具有明显影响,提示ΔtolA缺失株有作为弱毒疫苗候选株的潜力。2 APEC E058株tolA基因缺失对其外膜囊泡产出的影响通过超滤浓缩超离的方法提取E058野生株和ΔtolA缺失株分泌的OMVs,经透射电镜观察两者OMVs形态、BCA试剂盒检测蛋白浓度、SDS-PAGE对蛋白图谱进行比较分析、检测不同浓度OMVs对HD11细胞胞内相关酶活的影响。透射电镜观察OMVs形态结果显示,野生株和缺失株的OMVs在形态上没有明显区别,均为球形双层膜结构。BCA试剂盒检测结果显示,在培养相同菌量的条件下,ΔtolA缺失株提取的OMVs蛋白含量高于野生株,从浓度上提高了 3.25倍。SDS-PAGE电泳结果显示,缺失tolA基因后,OMVs蛋白图谱有所改变。OMVs与HD11细胞共培养试验结果显示,ΔtolA-OMVs能够显著提高胞内酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,表明tolA介导的OMVs能够激活巨噬细胞并增强巨噬细胞的免疫功能。3 APEC E058株tolA基因缺失株OMVs的免疫保护效力的初步研究为了评价APEC E058株tolA基因缺失株OMVs的免疫保护效力,本研究用提取的E058野生株和ΔtolA缺失株的OMVs免疫商品鸡,进一步对OMVs所产生的免疫保护效果进行研究。通过提取细菌外膜蛋白(Outer Membrane Proteins,OMPs),建立间接ELISA方法检测OMVs免疫所产生的特异性抗体水平,另外,通过玻板凝集试验检测免疫血清整体抗体效价水平。结果显示,OMVs具有良好的免疫保护效果,E058-OMVs免疫组的保护率可以达到80%以上,Atol4-OMVs免疫组保护率可以达到90%以上。经间接ELISA方法测定,Atol4-OMVs免疫组可以达到较高的IgG水平,且高于E058-OMVs免疫组。病理组织学观察显示,AtolA-OMVs免疫后对APEC造成的组织损伤具有明显的抑制作用。


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