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鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2W_(Δ11))功能及其调控机制的研究

靳锴  
【摘要】:性别决定(Sex Determination)是一个复杂且可塑的发育过程,一直以来都是生物学,医学和畜牧学等领域的研究热点。研究性别决定的机制不仅对于理解生物的发育和分化具有重要意义,而且能够有效的提高经济动物的生产效率。尤其是鸡的性别与生产力关系极大,在家禽生产中,商品蛋禽中雌禽的生产效益远高于公禽;而在肉禽生产中,雄禽生长快,产肉多,饲料报酬均显著地高于雌禽。因此如果能够有效的控制鸡的性别,能够大幅提高其生产效率,并能够避免在出生时对雏鸡进行淘汰而带来的资源浪费和相关的伦理问题,其重要性和意义不言而喻。因此一直以来,建立高效和准确的性别控制方法都是家禽生产研究中的热点。然而,迄今为止鸡性别决定的具体机制仍不清楚,极大的制约了性别控制技术在家禽生产中的研究与开发,与此同时也影响了鸡作为模型在病毒学,胚胎学,发育生物学和转化医学等领域的应用,所以迫切的需要对其性别决定的机制进行深入的探索。近年来,研究表明可变剪切作为一种重要的调控方式不仅广泛的参与生物的生命活动,同时也深入的参与了性别决定过程,果蝇中Sxl和小鼠中Sry基因性别决定过程中均发现存在可变剪切的调控。虽然目前有研究指出在鸡胚胎发育过程中存在可变剪切事件,表明可变剪切事件参与了鸡胚胎的性别决定过程,然而可变剪切在鸡(或鸟类)性别决定过程中的作用与功能仍需进一步的探究。基于此,本研究利用最新的单分子实时测序技术PacBio Sequel Ⅱ与传统的二代测序技术Illumina HiSeq系统的研究了鸡胚胎性别决定过程中关键时间点的基因表达和两性可变剪切差异,发现并鉴定出鸡性染色体同源基因SMAD2在W染色体上存在特异性可变剪切表达SMAD2W△11,并通过体内外实验证明其在性别决定中的生物学功能,并对其机制进行了探究。为鸡(鸟类)性别决定机制的研究提供参考依据,并为后续深入研究鸡性别决定过程中其他基因可变剪切事件的功能和机制提供了了理论支撑。具体的研究结果如下:(1)多组学测序显示W染色体基因SMAD2在鸡胚的性别决定过程中存在特异表达的转录本对性别决定不同时期的雌雄胚胎(E0,HH Stage 1),生殖腺(E3.5-E6.5,HH Stage 21-HH Stage 30)和性腺(E18.5,HH Stage 44)的组织样本进行二代测序,实验结果发现整体样本间的整体转录水平差异较小,进一步的分析显示两性之间在胚胎期(E0,HHStage 1)存在84个差异基因,其中在雄性中高表达基因37个,雌性中高表达基因47个,性染色体上基因62个(Z:30,W:32);两性在生殖腺组织的决定过程中差异表达基因数目分别为122(E3.5,雄性40,雌性82),59(E4.5,雄性14,雌性45),59(E5.5,雄性22,雌性37)和124(E6.5,雄性46,雌性78),其中性染色体上的差异基因分别为65个(E3.5,Z:27,W:38),44 个(E4.5,Z:8,W:36),22 个(E5.5,Z:1,W:21)和 53 个(E6.5,Z:16,W:37);在性腺组织(E18.5,HHStage44)中存在 3000个差异基因,在雄性中高表达基因有1952个,雌性中高表达基因有1048个,其中性染色体上基因243个(Z:206,W:37)。对性别决定不同时期的雌雄胚胎(E0,HHStage 1),生殖腺(E3.5-E6.5,HH Stage21-HHStage30)和性腺(E18.5,HH Stage 44)的组织样本进行混样,根据性别分为雌性和雄性两组进行建库和三代单分子实时测序(SMRT)。雄性SMRT文库共产生了共检测出56,844,862条Subreads,雌性SMRT文库共检测出53,056,064条Subreads。进一步的处理后获得26,089条雄性非冗余转录本,雌性23,889条非冗余转录本。对两性差异分析的结果显示两性全长转录本在性别决定过程中的常染色体上差异较小,但是在性染色体上差异较大,其中在雄性在Z染色体上的特异表达转录本为417条,W为0,而雌性在Z染色体上特异表达的转录本为208条,在W染色体上为60条,分析结果显示有12个基因在W染色体上存在雌性特异表达的转录本,分别是UBP2,UBE2R2,ZSWIM6,SPIN和SMAD2等基因。将三代测序结果与二代测序中不同时期和性别中的转录本表达量进行联合分析,发现W染色体上SMAD2基因存在特异的可变剪切,且在两性性别决定过程中存在表达差异。在胚胎发育的0天,两性Z染色体上SMAD2转录本的表达无差异,而在性别分化阶段(3.5天,4.5天,5.5天和6.5天),雄性中SMAD2Z的转录本表达均高于雌性,与此同时,结果显示18.5天的生殖腺中雄性SMAD2Z的表达显著高于雌性。相反的是,在整个发育阶段,雄性中均未检测到SMAD2W的表达,在雌性中,SMAD2W在3.5天-6.5天均存在表达,在18.5天转录本的表达量较高。这些结果表明SMAD2Z和SMAD2W可能在鸡胚胎雌性发育中扮演不同的作用。(2)体内外研究SMAD2Z和SMAD2W可变剪切在鸡胚性别决定过程中的功能分别鉴定和克隆SMAD2Z和SMAD2W的全长及对应的可变剪切体,qRT-PCR结果发现在早期两性胚胎发育过程中两性SMAD2Z和雌性SMADW中的均存在可变剪切表达,其中两性中SMAD2Z的mRNA表达以SMAD2ZFL和SMAD2ZΔ3为主,雌性中SMAD2W的mRNA表达则是以SMAD2WFL,SMAD2W△3 和 SMAD2W△11 为主。进一步的 Northern Blot 结果证明 SMAD2W 可变剪切体SMAD2W△11在卵巢中真实存在且特异表达。在此基础上针对SMAD2Z和SMAD2W全长及其可变剪切体的序列成功构建对应的慢病毒过表达载体并验证活性,与此同时依据其共有序列部分构建了 3条SMAD2的干扰载体,并验证活性后选择干扰效率最好的载体进行慢病毒包裹。在体外成功分离了两性CEF细胞系并进行了进一步的培养和鉴定,分别在DF-1细胞和两性CEF细胞上对SMAD2Z全长和SMAD2W△11的功能验证,发现无论是在DF-1细胞上,还是在两性CEF细胞中,干扰SMAD2后,雄性相关基因的表达出现下降,而雌性相关的基因上升,过表达SMAD2Z后,出现了相反的现象。与此同时,过表达SMAD2W△11能够引起雌性相关基因的表达上升,而雄性相关基因的表达出现下降。通过在鸡胚上建立高效的鸡胚体内注射模型并进行功能验证,组织学观察的结果发现干扰SMAD2能够诱发性腺由雄性向雌性表型的性别反转(7/34,20.59%),而过表达SMAD2W△11也会诱发性腺由雄性向雌性反转(10/46,21.73%),而同时干扰SMAD2和过表达SMAD2W△11则能够进一步促进这种现象(23/41,56.10%),与此相反的是单独过表达SMAD2Z,则会诱发性腺由雌性向雄性反转(21/44,47.73%)。Western Blot和qRT-PCR对性别相关基因的检测结果进一步验证了表型变化的准确性。这些结果共同表明SMAD2Z能够诱导胚胎向雄性决定,而SMAD2W△11则会诱导胚胎向雌性方向决定。(3)SMAD2W△11调节鸡胚雌性性别决定的分子调控机制探究分别构建SMAD2Z和SMAD2W△11的His标签原核融合表达载体,诱导表达和纯化后进行鉴定,通过His-Pulldown和质谱(MS)技术分别鉴定SMAD2Z和SMAD2W△11在卵巢和睾丸中的结合蛋白差异,发现差异蛋白集中在分化发育相关通路,激素合成和蛋白后修饰过程相关通路中,其中性激素合成通路关键基因CYP19A1在卵巢中与SMAD2W△11存在特异结合。通过Co-IP技术进一步验证了 His-Pulldown互作的准确性,并进一步的对CYP19A1在鸡胚性别决定过程中的功能进行验证。体内的验证结果表明,CYP19A1的过表达能够有效的促进鸡胚向雌性方向决定,而干扰则会导致鸡胚向雄性方向决定。综合上述结果可以得出推论,W染色体上特异的可变剪切体SMAD2△11能够通过结合CYP19A1促进鸡胚雌性性别决定过程,其具体的机制仍然有待进一步的研究。


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1 靳锴;鸡性别决定过程中SMAB2可变剪切体(SMAD2W_(Δ11))功能及其调控机制的研究[D];扬州大学;2021年
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