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禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性

秦爱建  
【摘要】: J亚群禽白血病病毒(ALV—J)是90年代由英国鉴定出来的ALV新的亚 群,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病。ALV—J的囊膜蛋白决定病毒的表型和病毒 中和反应类型。本研究应用PCR的方法从感染了ALV—J美国分离株ADOL- 4817和ADOL—Hc1的DF1细胞中分别扩增出特异性囊膜基因(env),并克隆进 大肠杆菌TA载体,得到了相应env克隆的重组质粒TA—4817env和TA-Hc- env。对ADOL—4817 env基因进行定序分析表明,ADOL—4817株env基因大 小为1746b,经计算机分析可翻译成581个氨基酸的蛋白质,分子量为 64643daltons;经翻译后再加工的gp85和gp37由517个氨基酸组成,分子量为 57677 daltons。ADOL—4817 env蛋白质有15个潜在的糖基化位点,氨基酸序列 分析进一步表明,虽然在整个env与ALV—J原型毒株HPRS—103相比有一些 氨基酸的变异,但整个env基因表达的囊膜糖蛋白的结构特性如多肽前导序列、 表面结构域、穿膜结构域等都比较保守。然而,ADOL—4817env蛋白的C末端比 其它毒株多了13个氨基酸残基。不同ALV—J毒株的env基因比较结果表明, ADOL—4817与已发表的ALV—J其它毒株序列有很高的同源性,其中gp85的 同源性为88.3—95.1%,gp37的同源性为88.8—92.4%;但与ALV的A—E亚 群的同源性仅24.6—51.4%。 本研究构建了env基因杆状病毒转移性载体质粒PBac4817env和PBacHc— env,通过与载体杆状病毒Bac—N—blue的DNA在SF9细胞上进行共转染,经 筛选获得重组杆状病毒rBac4817env和rBacHc—env。免疫荧光试验(IFA)结果 证明,感染了这二株重组杆状病毒的Sf9细胞能够表达ALV-J的env基因产 物,主要蛋白质分子量大小约为90—94kDa。糖基化分析结果证明,重组env基因 产物是糖基化蛋白质,重组env基因产物对ADOL—Hc1感染的CEF有明显的抑 制作用。用表达的基因产物对鸡进行免疫,可以诱导鸡产生对ALV—J env蛋白的 特异性抗体。 本研究用重组杆状病毒表达的基因产物免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制 备出抗ALV—J囊膜糖蛋白的特异单隆抗体。试验结果证明,所获得的单抗G2, JE9和I45是抗ALV—J亚群特异性的单抗;另一株单抗J47则是对所有外源性 ALV(A、B、C、D和J)特异的单克隆抗体,对内源性E亚群不反应。用单抗JE9 对我国分离到的6株ALV—J感染的(CEF)鸡胚成纤维细胞作IFA时,来自病鸡 的二株呈强阳性,另二株呈弱阳性,还有二株为阴性。这表明,我国已存在着一些 在抗原性上与欧美流行毒株不完全相同的ALV刁野毒株。用单克隆抗体对感染 鸡组织中抗原的检测结果证明,单克隆抗体光 和GZ可以检测出感染鸡组织中 ALV—J抗原,并具特异性。对不同组织检测结果还证明,肾脏组织含毒量较高。 Tunicamycin的敏感性实验证明,90—94kDa蛋白质是 env基因产物的糖基 化形式,53kDa蛋白质可能是囊膜蛋白的非糖基化形式。用糖耷酶 PNGase F处 理a 细胞表达的env基因重组产物,原有的90—94kDa的蛋白质消失,产生出 分子量约 57kDa的蛋白质条带,提示 ALV—J env基因产物主要含有以能被 PNGase FN分解的 N一连接的糖基。Tunicamycin能显著降低ALV—J在感染 细胞中的病毒滴度,但病毒的囊膜蛋白基因仍然能够正常转录、转译和合成,只是 不能被糖基化,因而未糖基化的ALV—J病毒不能感染宿主细胞。免疫荧光试验 检测经Tunicamycin处理的病毒感染的细胞,结果呈现阴性反应,提示非糖基化 的囊膜蛋白不能被再加工,因而不能表达于感染细胞的表面。综述这些结果,糖基 化作用对ALV—J病毒的成熟和再感染十分重要。 在大肠杆茵中以GST $合蛋白的形式分别表达了ADOL4817株env的基因 的不同片段,它们与不同株单克隆抗体反应的结果证明,单抗拍 和GZ针对的抗 原表位位于 env蛋白 N一端第 65—155 %基酸区域,单抗 145所针对的抗原表位 位于第 157—233 #基酸区域。这是我们首次用实验证明了,ALV叶亚群的特异 性决定于多肽的氨基酸排列顺序,而与糖基化无直接关系。同时也是首次确立了 抗ALV—J的不同单抗所识别的表位的位丘。进一步用细茵表达的env基因片段 GSTat合蛋白制得的小白鼠抗血清与 ADOL—HCI和 ADOL—4817二株 ALV —J病毒进行中和试验表明,所有抗血清均不能完全中和 ADOL—H。1和 ADOL —4817对鸡胚成纤维细胞的感染作用,但抗 pGEX—TJM6—GST(能表达 env基 因的Vr3区)血清有一定程度的抗ADOL—4817$染CEF作用,统计分析差异显 著(P(0.001)。这一结果提示T env基因产物的 Vr3区域在 ALV—J的病毒中和 活性和干扰活性中起主要决定作用。


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