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马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的分子生物学特性

丁家波  
【摘要】: 参照马立克氏病病毒(MDV)强毒参考株GA囊膜糖蛋白I(gI)的基因序列, 设计合成一对引物,其两端分别含KpnI和BamHI的酶切位点。分别以特超强毒 648株、国际疫苗毒CVI988株、中国疫苗毒814株及中国超强毒G2株马立克氏 病病毒基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR),扩增出MDV囊膜糖蛋 白I基因(gI)。将gI克隆进pUC18载体中进行序列测定,并将所得的4株MDV gI 的序列与GA株进行比较,分析基因同源性。结果表明,gI基因的核苷酸序列保 守性大于99.2%,变异相对集中于gI基因的中部,在200-900bp之间。 根据gI的变异特点,结合DNAstar对其抗原性和疏水性的分析,重新设计一 对引物,以特超强毒648株基因组DNA为模板,扩增其166-1069bp之间904bp 核苷酸序列。PCR产物被克隆进pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下 游。重组质粒转化宿主大肠杆菌BL_(21)后,在1.0mM IPTG和30℃条件下诱导表达。 诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,确定为 预期的63KD的融合表达条带,用山羊抗GST抗体进行Western-blot试验,结果 确证了融合蛋白的表达。 在建立重组菌的生长曲线的基础上,通过调节IPTG浓度、诱导时间和诱导温 度,探索gI的最佳表达条件,并在该条件下大量诱导重组菌。将表达产物从 SDS-PAGE凝胶中切出回收,初步定量后免疫一月龄ICR小鼠。5次免疫后,采血 分离血清,所得抗血清与分别与RB1B株、GA株和CVI988株马立克氏病病毒感 染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明,大肠杆菌 表达的gI基因至少保留了部分天然gI蛋白的抗原性。 根据pSV-β载体的酶切位点,重新设计一对引物,将gI基因克隆进pSV-β载 体SV40启动子下游。大量制备克隆质粒,纯化并定量,通过基因免疫的方法,探 索gI基因的体内表达效果。结果显示,试验组IFA呈阳性,但效价较低。 本研究在国际上首次完成了从弱毒到特超强毒所代表的不同致病性MDV毒株 的gI基因的序列比较,通过绘制进化树,显示了不同毒株gI基因的进化关系;确 立了pGEX表达载体表达外源基因的最佳条件;证明了基因免疫亦可诱导对MDV gI的抗体反应。通过本文对gI的研究,为进一步研究该基因,制备gI蛋白的单抗 以及为研究MDV的其它基因提供了一些可供借鉴的方法。


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